【摘要】：研究背景:卵巢癌在妇科恶性肿瘤的死亡人数中排名第一。据预测,美国约13980名卵巢癌患者将于2019年丧生。卵巢癌的治疗以手术和术后化疗药物的综合治疗为主,但复发率仍居高不下,超过85%。由于耐药性的出现,影响EOC的PFS和OS。因此,关于如何逆转卵巢癌耐药分子机制的研究引起人们广泛关注。Curcumin,来自一个黄色的饮食风味的植物(姜黄),据报道对卵巢癌有治疗作用,并进行了临床试验发现具有诱导肿瘤细胞凋亡的效应。有研究报道Curcumin可诱导癌细胞凋亡性死亡,发挥抗癌作用,然而,在EOC治疗中,Curcumin的耐药性限制了临床应用。最近的研究表明,Curcumin在癌症细胞中表现的耐药性与自噬密切相关。细胞内自噬是为了维持体内环境的平衡。研究结果表明,Curcumin诱导的自噬不仅是促进死亡信号,也是一种对应激的适应,以避免细胞死亡和细胞凋亡,导致化疗耐药。研究表明卵巢癌在药物中表现的耐药性与自噬的保护作用有关。Curcumin在各种癌症研究中被确认为自噬诱导因子,如黑色素瘤、胶质瘤、乳腺癌和口腔癌。因此,抑制自噬可能是克服Curcumin对卵巢癌耐药障碍的有效途径。自噬抑制剂,如氯喹(CQ),与化疗药物和放疗联合使用时具有增强抗肿瘤作用,提示其在抗癌治疗中具有重要作用。因此,自噬抑制剂对于解决Curcumin在卵巢癌的耐药性有着巨大的潜力。本课题探讨了 Curcumin在治疗卵巢癌细胞发生耐药的分子机制。研究自噬的保护作用在Curcumin发生耐药中的关键作用,探讨使用自噬抑制剂是否可以逆转Curcumin在卵巢癌发生耐药的机制。研究目的:本课题探讨了 Curcumin在治疗卵巢癌细胞发生耐药的分子机制。研究自噬的保护作用在Curcumin发生耐药中的关键作用,探讨使用自噬抑制剂是否可以逆转Curcumi n在卵巢癌发生耐药的机制。研究材料:在本研究中,SK-OV-3和A2780人卵巢癌上皮性细胞株购自ATCC。HO-8910人卵巢癌上皮性细胞系和HEK-293T人胚肾细胞系购自中国科学院(上海)。SK-OV-3和A2780通过转染后经嘌呤霉素筛选构建敲减LC3B的稳定SK-OV-3-pLKO.1-shLC3B和A2780-pLKO.1-shLC3B细胞株,同时建立与之对应的对照细胞株SK-OV-3-pLKO.1-NC和A2780-pLKO.1-NC。研究方法:MTT测定法、EdUU细胞增殖测定法、细胞集落形成测定法以及流式细胞检测不同浓度Curcumin作用SK-OV-3和A2780在各个时间点的细胞活力。Curcumin对SK-OV-3和A2780细胞中凋亡相关蛋白表达用Western blot检测。电镜下观察A2780细胞自噬囊泡、荧光显微镜下观察自噬标记LC3免疫荧光检测SK-OV-3和A2780细胞自噬体等方法验证Curcumin处理后的SK-OV-3和A2780细胞系存在自噬作用。应用PI3K抑制剂LY294002以及质粒构建过表达AKT的SK-OV-3细胞系,Cur cumi n诱导SK-OV-3和A2780细胞发生的自噬保护作用与自噬相关的AKT/mTOR/p70S6K信号通路中靶蛋白分子有相关性由Western blot确认。自噬抑制剂氯喹及shRNA稳定敲除自噬靶点分子LC3B作用后,通过MTT测定法、EdU细胞增殖试验法、流式细胞术及Western blot反向证明Curcumin在SK-OV-3和A2780细胞系上的自噬诱导。统计软件SPSS 23.0分析实验数据,P0.05统计学有差异。所有结果均为三次独立性实验所得,结果表示为mean和SD。研究结果:1.Curcumin对SK-OV-3、A2780和HO-8910细胞活力的影响MTT法检测Curcumin对SK-OV-3、A2780和H0-8910细胞活力的影响:Curcumin(0、5、10、20、40、80μM)处理24h、48h和72h对SK-OV-3、A2780和HO-8910细胞的生长抑制作用,结果显示Curcumin降低了三种卵巢癌细胞系SK-OV-3、A2780和H0-8910的细胞活力,生长抑制以浓度依赖性和时间依赖性方式表现,差异有统计学意义(P0.05)。Curcurmin的IC50值:SK-OV-3细胞系在24h、48h和72 h分别为41.05、31.84和30.29μM;A2780细胞系在24h、48h和72h分别为18.37、13.26和13.83 μM;HO-8910细胞系在24h、48h和72h分别为18.93、14.46和13.92 μM。细胞集落形成实验用于观察Curcumin对EOC细胞增殖的长期抑制。10 μM浓度的Curcumin明显抑制SK-OV-3细胞系的克隆形成能力。EdU细胞增殖试验用于验证Curcumin是否对细胞增殖有直接作用,在SK-OV-3细胞中,用Curcumin处理48h后,EdU的摄取率明显受到抑制且呈浓度依赖性,表明Curcumin对SK-OV-3、A2780和H0-8910卵巢癌细胞系具有杀伤作用。差异均有统计学意义(P0.05)。2.Curcumin对SK-OV-3和A2780卵巢癌细胞凋亡的影响采用流式细胞仪检测SK-OV-3和A2780细胞凋亡:Curcumin30 μ M就可以显著诱导A2780细胞系的细胞凋亡,浓度到达40μM后,能显著诱导SK-OV-3细胞系的细胞凋亡,差异有统计学意义,P0.05。应用Western blot分析Curcumin对Caspase和PARP活性的影响,显示Curcumin激活了Caspase-9和PARP,提示EOC细胞中Caspase活化引起的细胞凋亡与Curcumin诱导的细胞死亡有关联。3.Curcumin诱导卵巢癌细胞SK-OV-3和A2780细胞产生自噬现象的机制电镜观察卵巢癌A2780细胞的超微结构,15 μ M的Curcumin处理48h后的卵巢癌A2780细胞,结果表明用Curcumin处理的A2780细胞组与对照A2780细胞组相比存在大量自噬泡。SK-OV-3细胞的免疫荧光染色证实,自噬特异标记物LC3B在Curcumin作用下增加其荧光表达。与对照组相比,40μ MCurcumin作用SK-OV-3细胞48h显示出LC3B荧光形成密度和强度的显著增加,表明Curcumin可诱导SK-OV-3细胞发生自噬。差异有统计学意义(P0.05)。Western blot评估SK-OV-3和A2780自噬相关蛋白的表达。不同浓度Curcum in作用48h后,提取蛋白利用We stern blot检测自噬相关靶点分子LC3B、Atg3、Beclin-1、P62蛋白表达,与对照组相比,Curcumin处理后的LC3B-II表达显著增加(差异有统计学意义,P0.05),明显上调Atg3、Beclin-1表达,明显下调P62表达,且均以剂量依赖性表现,表明Curcumin可以诱导卵巢癌细胞SK-OV-3和A2780产生自噬现象。4.自噬抑制剂加强Curcumin治疗卵巢癌细胞SK-OV--3和A2 780的敏感性使用自噬抑制剂探讨Curcumin诱导的自噬在SK-OV-3和A2780中发挥的作用。选用自噬抑制剂中的CQ,通过MTT检测发现与单独应用Curcumin相比,联合应用CQ和Curcumin后,明显降低SK-OV-3和A2780的细胞活力,说明CQ可增强Curcumin诱导的细胞死亡。凋亡检测也证实CQ和Curcumin联合组的凋亡率明显高于独立使用的Curcumin组。采用Ed U细胞增殖检测法,验证Cur c um i n和CQ联合是否对细胞增殖有直接影响,结果显示:与独立使用Curcumin相比,CQ和Curcumin联合显著抑制SK-OV-3的EdU摄取率,说明自噬抑制剂CQ阻断自噬的同时增加了Cur cumin诱导的细胞凋亡能力,与Cur cumin药物联合应用发挥抗卵巢癌作用。差异是否有统计学意义(P0.05)。5.LC3B在Curcumin诱导的卵巢癌细胞SK-OV-3和A2780自噬中的作用构建了shRNA稳定敲减LC3B的SK-OV-3和A2780卵巢癌细胞系。Western blot显示,在稳定敲减LC3B的SK-OV-3和A2780细胞系中,相对于NC对照组(无目的基因病毒处理组),Curcumin处理后的LC3B-Ⅱ蛋白显著表达升高,(差异有统计学意义,P0.05)。另外,LC3B shRNA对Curcumi n介导SK-OV-3和A2780发生细胞凋亡的影响中发现cleaved Caspase-9和cleaved PARP的蛋白表达上调,说明Curcumin处理后的LC3B稳定敲除的SK-OV-3和A2780凋亡率明显高于Curcumin处理的NC对照SK-OV-3和A2780细胞系,也就是说,敲减LC3B增强了Curcumin治疗EOC细胞SK-OV-3和A2780的敏感性。6.Curcumin在卵巢癌细胞SK-OV-3和A2780中发生保护性自噬的机制研究采用不同浓度Curcumin(0、10、20、40OμM用于SK-OV-3卵巢癌细胞系,而0、7.5、15、30μM用于A2780卵巢癌细胞系)对SK-OV-3细胞和A2780细胞作用处理48h后,提取蛋白并检测AKT/mTOR/p70S6K信号通路中相关分子的蛋白表达,结果显示:与对照组相比,p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K、p-4E-BP1的蛋白表达量显著下调,以浓度依赖性表现(差异有统计学意义,P0.05),而t-AKT、t-mTOR的蛋白表达无明显差别,结果证实Curcumin是通过抑制AKT/mTOR/p70S6K通路诱导EOC细胞SK-OV-3和A2780自噬发挥保护作用。瞬时转染AKT过表达质粒入SK-OV-3中,构建AKT过表达SK-OV-3细胞。Western blot显示,过表达AKT的SK-OV-3卵巢癌细胞加Curcumin处理48h后提取总蛋白,LC3B-II的表达下调,并且逆转了Curcumin诱导的细胞死亡。差异有统计学意义,P0.05。PI3K抑制剂LY294002预处理细胞,抑制AKT表达,Curcumin处理SK-OV-3和A2780细胞48h后提取总蛋白,LC3B-II表达上调,导致Curcumin诱导的细胞死亡。结果表明,下调AKT显著促进Curcumin诱导的SK-OV-3和A2780细胞死亡和自噬。差异有统计学意义,P0.05。研究结论:1.Curcumin诱导EOC细胞凋亡机制,杀伤EOC细胞而抑制EOC;2.Curcumin抑制AKT/mTOR/p70S6K通路,诱导卵巢癌细胞产生保护性自噬而发生治疗EOC的耐药;3.自噬抑制剂CQ可增敏Curcumin的抗EOC细胞作用。创新性及意义:1.首次发现了 Curcumin联合自噬抑制剂发挥协同抗卵巢癌效应;2.提出了自噬抑制剂可通过抑制Curcumin诱导的保护性自噬来增强Curcumin抗卵巢癌效应;3.解决EOC细胞凋亡抵抗和EOC化疗耐药提供了新的方向。局限性:1.未进行动物和临床实验,探讨Curcumin对卵巢癌的治疗作用;2.未能对Curcumin作用的主要靶点分子进行探究。
【图文】：
图２：邋Ｃｕｒｃｕｍｉｎ对ＳＫ－ＯＶ－３和Ａ２７８０细胞凋亡的影响逡逑（Ａ）．采用Ａｎｎｅｘｉｎ邋Ｖ邋（Ｘ轴）－ＰＩ邋（Ｙ轴）－流式细胞实验定量分析ＳＫ－ＯＶ－３逡逑和Ａ２７８０细胞经浓度梯度的Ｃｕｒｃｕｍｉｎ处理后细胞凋亡。左：流式细胞逡逑凋亡图，，右：ＳＫ－０Ｖ－３和Ａ２７８０细胞凋亡率逡逑
Ｃｕｒ（ｐＭ）邋０逦１０逦２０逦４０逦０逦７．５逦１５逦３０逡逑图３：邋Ｃｕｒｃｕｍｉｎ诱导卵巢癌细胞ＳＫ－ＯＶ－３和Ａ２７８０发生自噬逡逑的机制逡逑（Ａ）．电镜观察Ａ２７８０细胞经Ｃｕｒｃｕｍｉｎ处理４８ｈ及其对照组。黑色箭头逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.31
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 连红梅;姜丽华;;右美托咪定对卵巢癌细胞相关生物学行为的影响[J];实用药物与临床;2018年04期
2 李嫣;汤小晗;卢美松;;表皮生长因子受体信号通路对卵巢癌细胞自噬的调控[J];国际妇产科学杂志;2017年02期
3 尹雅洁;盛修贵;王兴武;高楠;王菲;邓祥云;;葡萄糖对卵巢癌细胞生长增殖影响体外研究[J];中华肿瘤防治杂志;2017年10期
4 ;发现休眠卵巢癌细胞存活机制[J];生命世界;2009年02期
5 ;美发现休眠卵巢癌细胞存活机制[J];医学研究杂志;2009年04期
6 张晶晶;王波;;卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞相互作用对卵巢癌细胞运动及侵袭的影响[J];实用妇产科杂志;2006年04期
7 余志英,周霞平,杜静,张金超,罗军,柯玮琳;紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡及基因调控的研究[J];华中科技大学学报(医学版);2005年03期
8 仲任,黄瑞滨,宋善俊;组织因子途径抑制物2对卵巢癌细胞迁徙和浸润能力的影响(英文)[J];The Chinese-German Journal of Clinical Oncology;2005年01期
9 余志英,杜静,张金超,李丽文,初虹,柯玮琳;紫杉醇对卵巢癌细胞端粒酶活性影响的研究[J];实用肿瘤学杂志;2005年02期
10 张颐,尚海,董武,赵杨,孙黎光;丝裂原活化蛋白激酶激酶1抑制剂PD98059对卵巢癌细胞生长的影响[J];中华妇产科杂志;2004年06期
相关会议论文 前10条
1 王文霞;孔北华;李鹏;曲迅;;蛋白酶体抑制剂对卵巢癌细胞的作用机制[A];第八次全国妇产科学学术会议论文汇编[C];2004年
2 张向宁;李晓翠;马道新;;67kDaLN-R反义寡核酸对卵巢癌细胞生物学行为影响[A];第八次全国妇产科学学术会议论文汇编[C];2004年
3 唐东平;陈心秋;唐凯;张洁清;贺海平;;11种化疗药物对卵巢癌细胞的抑制作用及其有核细胞细胞毒性研究[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年
4 吴卉娟;翁丹卉;邢辉;宋晓红;卢运萍;王世宣;马丁;;PTEN抑癌基因逆转卵巢癌细胞的多药耐药及相关机制[A];中华医学会第一届全球华人妇产科学术大会暨第三次全国妇产科中青年医师学术会议论文汇编[C];2007年
5 许沈华;牟瀚舟;顾琳慧;朱赤红;刘祥麟;;高转移卵巢癌细胞差异表达基因在染色体定位及其功能[A];浙江省生理科学会2006年学术年会论文汇编[C];2006年
6 赵志伟;吴江;姜光瑶;吕鑫;郭鹏;;剪应力诱导卵巢癌细胞上皮-间质转化的研究[A];第十一届全国生物力学学术会议暨第十三届全国生物流变学学术会议会议论文摘要汇编[C];2015年
7 刘娟娟;林蓓;赵越;李飞飞;郝莹莹;张帆;朱连成;张淑兰;;岩藻糖基化抗原对卵巢癌细胞生物学行为的影响[A];东北三省第四届妇产科学术会议论文汇编[C];2008年
8 袁令芹;盛修贵;;谷氨酰胺对卵巢癌细胞增殖作用影响的研究[A];第八届中国肿瘤学术大会暨第十三届海峡两岸肿瘤学术会议论文汇编[C];2014年
9 胡晓霞;李力;黎丹戎;张玮;唐步坚;;MMP-9反义寡核苷酸对卵巢癌细胞体外侵袭粘附的抑制作用[A];中华医学会第九次全国妇科肿瘤学术会议论文汇编[C];2006年
10 梁念慈;何太平;覃燕梅;吴科锋;;抗癌草药半边旗有效成分对卵巢癌细胞基因表达的影响[A];第十届全国生化与分子药理学术会议论文摘要汇编[C];2007年
相关重要报纸文章 前9条
1 邰 举;韩国医学专家发现精液能够杀死卵巢癌细胞[N];中国中医药报;2003年
2 邰举;精液能够杀死卵巢癌细胞[N];科技日报;2003年
3 靖九江;4-HPR有望用于治疗卵巢癌[N];中国医药报;2005年
4 记者 任海军;卵巢癌为何常常复活？生死命悬一基因[N];新华每日电讯;2009年
5 任海军;美找到卵巢癌易复发原因[N];大众卫生报;2009年
6 本报记者 王燕宁邋通讯员 陈亚新 屈骞;恶性肿瘤到底能不能预防？[N];科技日报;2008年
7 晓明;美研究发现应对耐药新方法[N];中国医药报;2008年
8 胡德荣;发现卵巢癌生长新机制[N];健康报;2006年
9 黎生;摄入姜和胡椒粉可防癌抗癌[N];医药经济报;2007年
相关博士学位论文 前10条
1 刘娇阳;Claudin-6对卵巢癌细胞SKOV3生物学行为影响的研究[D];南方医科大学;2018年
2 袁犁;miR-124通过靶向PDCD6抑制卵巢癌细胞及诱导凋亡机制的研究[D];重庆医科大学;2016年
3 李晓燕;shRNA介导的Ambra1基因敲除降低卵巢癌细胞自噬并提高细胞对顺铂敏感性的研究[D];山东大学;2018年
4 秦姗;NANOG基因在卵巢癌细胞迁移、侵袭及耐药中的作用探讨[D];河北医科大学;2018年
5 郭恩松;AZD1775上调卵巢癌细胞PD-L1的机制探究及其联合αPD-L1治疗卵巢癌的潜在价值[D];华中科技大学;2018年
6 金爱红;抑制miR-23a表达增强卵巢癌细胞顺铂敏感性的分子机制研究[D];安徽医科大学;2016年
7 余雪琛;SOS1/EPS8/ABI1在卵巢癌细胞转移起始中的作用及其靶向短肽抑制剂抗转移活性的研究[D];武汉大学;2015年
8 潘海波;茶黄素的UPLC分析及其对人卵巢癌细胞抑制作用和机制的研究[D];浙江大学;2018年
9 李霞;Evi1表达对卵巢癌细胞生物学行为及化疗敏感性影响的初步研究[D];郑州大学;2018年
10 孟莹;MARCH1促进上皮性卵巢癌恶性生物学行为及其机制的研究[D];重庆医科大学;2018年
相关硕士学位论文 前10条
1 尹建峰;基于财务能力分析视角的比亚迪财务报表分析[D];北京邮电大学;2019年
2 檀文韬;探究CUL4B表达对卵巢癌细胞的影响[D];南京医科大学;2019年
3 杨桂珍;木脂素Ovafolinin B的全合成研究[D];兰州大学;2019年
4 苗春影;SRD5A3对高级别浆液性卵巢癌发生发展影响及作用机制的研究[D];山东大学;2019年
5 刘立东;Curcumin对卵巢癌细胞作用的分子机制研究[D];山东大学;2019年
6 李文;miR-622调控MAPK1信号通路对卵巢癌细胞生物学功能的影响[D];郑州大学;2019年
7 张静静;B7-H3分子通过Jak2-Stat3通路调控卵巢癌细胞生物行为及其机制的研究[D];山东大学;2018年
8 侯小满;NOTCH1调控肿瘤干细胞相关基因表达影响卵巢癌细胞增殖和侵袭的研究[D];山东大学;2018年
9 刘芬芬;人表皮生长因子受体2与β-catenin/TCF7L2信号相互作用促进卵巢癌细胞转移[D];安徽医科大学;2018年
10 钟莉莉;MicroRNA-210影响卵巢癌细胞的生长和放射治疗疗效研究[D];吉林大学;2018年
本文编号：
2589526
