SRD5A3对高级别浆液性卵巢癌发生发展影响及作用机制的研究
发布时间：2020-04-01 08:31
【摘要】：背景与目的卵巢癌缺乏有效的早期诊治方法,患者大多预后不良,高级别浆液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer，HGSOC)恶性度较其他肿瘤类型高。尽管近年在HGSOC研究和治疗方面取得了显著进展,但HGSOC潜在分子发病机制仍有待进一步探索。类固醇-5α还原酶3(steroid-5a redutase3,SRD5A3)属于类固醇-5a还原酶家族中的一员,SRD5A3表达水平的上调与人类肿瘤表现恶性生物学行为之间存在一定的相关性。然而,SRD5A3在高级别浆液性卵巢癌中的表达水平及其发挥的生物学作用尚未完全阐明。该实验探究了SRD5A3在HGSOC组织及细胞系的表达与在正常输卵管伞组织及细胞系中的表达水平差异,并分析了 SRD5A3表达水平与HGSOC患者不良预后之间的关系,通过上调或者下调SRD5A3表达研究SRD5A3对HGSOC生物学行为的影响,探索其作为HGSOC患者预后标志物的潜力,及基因靶向治疗靶点的可能性。材料与方法通过实时定量PCR(RT-qPCR)及Western印迹(WB)分析SRD5A3在正常对照和癌组织中的表达。采用免疫组化技术分析SRD5A3在FT和HGSOC中的蛋白水平差异及SRD5A3表达水平与HGSOC患者生存期及临床生化特征之间的相关性。构建SRD5A3过表达及干扰表达的质粒,利用慢病毒感染技术建立过表达及干扰表达的稳定细胞。MTT及克隆形成实验用于研究SRD5A3对卵巢癌细胞生长和增殖的影响,Transwell实验用于研究SRD5A3在卵巢癌细胞侵袭和转移中的生物学作用。将一定浓度梯度的顺铂和SRD5A3小分子抑制剂应用于卵巢癌细胞,分析SRD5A3与卵巢癌细胞顺铂化疗耐药的关系,并通过MTT法检测顺铂和SRD5A3小分子抑制剂联合应用对顺铂治疗卵巢癌出现的化疗耐药的影响。研究结果HGSOC组织中SRD5A3的mRNA及蛋白表达水平显著高于FT组织;在HGSOC患者中SRD5A3高表达组的存活时间较SRD5A3低表达组短,且SRD5A3表达水平与HGSOC患者铂类化疗耐药、淋巴结转移之间具有相关性。SRD5A3表达上调后,卵巢癌细胞生长速度加快,克隆形成能力增强,周期检测结果表明过表达SRD5A3会促进卵巢癌细胞周期由G1期向S期转化,下调SRD5A3表达会导致卵巢癌细胞周期阻滞在G0/G1期;RT-PCR技术检测细胞周期相关分子mRNA水平结果表明,SRD5A3过表达后,A2780细胞系C-MYC,CDK2，CCNE1,CDK4，CDK6，CCND1 水平升高,P21,P27水平降低;SRD5A3干扰后结果相反;利用WB技术发现上述分子蛋白水平发生相应改变。迁移和侵袭实验表明,SRD5A3表达上调促进卵巢癌细胞穿越至Transwell小室下室;干扰SRD5A3后,结果相反;采用RT-PCR技术检测EMT相关分子及EMT相关转录因子的mRNA水平,SRD5A3过表达后上皮性标志分子E-cadherin水平降低,而间质性分子N-cadherin,vimentin,ZEB1水平升高,SRD5A3干扰后结果相反;利用Western Blot检测EMT相关分子及EMT相关转录因子的蛋白水平,SRD5A3过表达后上皮性分子E-cadherin表达下调,而间质分子N-cadherin,vimentin,ZEB1表达明显上调,SRD5A3干扰后结果相反。RT-PCR显示增加顺铂作用浓度,SRD5A3的mRNA水平增加;Western blot显示延长顺铂作用时间,SRD5A3的蛋白水平增加,而且上调SRD5A3的表达,自噬相关分子Atg12及LC3 I/II的蛋白水平增加,P62的蛋白水平减少,敲低SRD5A3的表达,结果相反;药物MTT实验显示增加小分子抑制剂作用浓度和作用时间,卵巢癌细胞的生长抑制率增加;耐药MTT实验显示增加顺铂作用浓度,SRD5A3干扰的卵巢癌细胞系细胞抑制率较对照对增加;将顺铂与小分子抑制剂联合应用对卵巢癌细胞的抑制作用强于将顺铂或小分子抑制剂单独应用。SRD5A3过表达后P13K，p-AKT，p-mTOR的蛋白水平升高,SRD5A3 干扰后P13K，p-AKT,p-mTOR的蛋白水平降低。研究结论1.SRD5A3在HGSOC中高表达,且其表达水平与HGSOC患者不良预后、铂类化疗耐药及淋巴结转移相关;2.SRD5A3通过调节卵巢癌细胞周期来增强卵巢癌细胞的生长和增殖;3.SRD5A3通过调节EMT相关分子的表达诱导卵巢癌细胞发生EMT,从而促进卵巢癌细胞发生侵袭和转移;4.SRD5A3通过促进卵巢癌细胞的自噬参与铂类化疗耐药;5.降低SRD5A3表达或者使用SRD5A3的小分子抑制剂可以增强顺铂化疗的敏感性;6.SRD5A3在卵巢癌中起的生物学功能伴有P13K/AKT/mTOR通路激活。因此,SRD5A3可能是潜在的HGSOC患者生存预后的标志物和其治疗的靶点。
【图文】：
ＲＮＡ及蛋白质，通过ＷＢ实验分析了邋ＳＲＤ５Ａ３在６例ＦＴ组织和１０例ＨＧＳＯＣ组逡逑织中蛋丨＇１表达水平，结果表明ＨＧＳＯＣ组织中ＳＲＤ５Ａ３的蛋白表达水平显著高于逡逑ＦＴ组织（Ｐ＜０．０００１图１Ａ）；随后我们通过ｑＲＴ－ＰＣＲ技术分析了邋１３例ＦＴ组织逡逑和２８例ＨＧＳＯＣ组织中ＳＲＤ５Ａ３的ｍＲＮＡ表达水平，发现与ＦＴ相比，ＨＧＳＯＣ组逡逑织中ＳＲＤ５Ａ３ｍＲＮＡ表达水平明显X椉樱ǎ校剑埃埃埃矗罚迹保拢晃颐侵谱髁寺殉舶╁义献橹酒ǎ裕停粒┎⑼ü桑龋萌旧际醴治隽隋澹樱遥模担粒吃冢矗袄疲宰橹停保罚崩义希龋牵樱希米橹校樱遥模担粒车鞍妆泶锼剑樱遥模担粒橙旧婪直曜嘉焊菔橹义锨衅旧咳酰浞治醇叮跣匀旧海胺郑跹粜匀旧海狈郑械妊粜藻义先旧海卜郑垦粜匀旧海撤郑ㄍ迹保茫桓菅粜韵赴旧婊俜直龋义掀浞治锤龅燃叮埃玻担ハ赴旧海狈郑玻叮担埃ハ赴旧海卜郑担保罚担ハ稿义习旧海撤郑罚叮保埃埃ハ赴旧海捶郑唤旧慷绕婪郑旧婊婪旨扑阄义献苋旧婪帧Ｆ婪纸峁允
本文编号：2610211
【图文】：
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