重组溶瘤腺病毒通过线粒体途径诱导人宫颈癌细胞凋亡研究

发布时间：2020-04-02 04:49

【摘要】：宫颈癌是全球女性中仅次于乳腺癌的第二大恶性肿瘤,宫颈癌高发年龄一般为30~55周岁,近年来其发病有年轻化的趋势。溶瘤腺病毒是非常有前途的癌症基因治疗药物,因为它们具有在恶性肿瘤细胞中选择性复制的特点,能够导致肿瘤细胞的溶解和炎症,本研究使用的重组溶瘤腺病毒Ad-VT是本实验室~([1])基于凋亡素基因Apoptin,肿瘤特异性启动子hTERTp,病毒复制必须基因E1A通过RAPAd.I腺病毒载体系统构建而成的具有肿瘤特异性复制和肿瘤特异性杀伤能力的溶瘤腺病毒。本实验室大量前期研究表明~([2-4]),Ad-VT构建方式可靠,能够稳定表达并且疗效显著,对胃癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、结直肠癌和前列腺癌等多种肿瘤细胞均具有显著的抑制作用,对正常的人体细胞无影响。前期研究表明Ad-VT完全具备进行后续实验的条件。目的:探究重组溶瘤腺病毒对人宫颈癌Hela细胞的抑制作用以及重组溶瘤腺病毒对Hela细胞凋亡的影响;进一步探究重组溶瘤腺病毒通过哪些途径诱导Hela细胞凋亡;最后重点研究Hela细胞线粒体凋亡途径。通过该研究对重组溶瘤腺病毒诱导肿瘤细胞凋亡途径进行初步认识。方法:1 Hela细胞线粒体提取与功能活性验证通过Minute线粒体分离试剂盒提取Hela细胞线粒体;通过Western Blot法检测提取出线粒体中线粒体内参蛋白COXⅣ水平从而验证线粒体纯度;通过检测提取出线粒体的ATP水平和活性氧水平验证线粒体的功能活性。2重组溶瘤腺病毒对Hela细胞抑制途径研究通过CCK-8法和乳酸脱氢酶释放实验明确重组溶瘤腺病毒对Hela细胞的抑制作用;通过Hoechst染色和AnnexinⅤ-FITC/PI流式检测探究重组溶瘤腺病毒对Hela细胞凋亡的影响;通过Transwell小室迁移实验和Biocoat小室侵袭实验探究重组溶瘤腺病毒对Hela细胞迁移和侵袭的影响;通过Western Blot法进行凋亡相关蛋白检测,初步研究重组溶瘤腺病毒诱导Hela细胞凋亡的途径。3重组溶瘤腺病毒通过线粒体途径诱导Hela细胞凋亡通过JC-1染色及JC-1流式检测探究重组溶瘤腺病毒对Hela细胞线粒体膜电位的影响;通过Minute线粒体分离试剂盒提取感染重组溶瘤腺病毒后的Hela细胞线粒体;通过对提取出的线粒体进行ATP和活性氧检测探究重组溶瘤腺病毒对Hela细胞线粒体功能活性的影响;通过Western Blot法检测线粒体凋亡途径相关蛋白的表达,初步研究重组溶瘤腺病毒诱导Hela细胞凋亡的线粒体途径。结果:1通过Minute线粒体分离试剂盒成功提取出了纯度较高且具有较好功能活性的线粒体。2通过CCK-8和乳酸脱氢酶释放试验,明确重组溶瘤腺病毒能够对Hela细胞起到抑制作用且该抑制作用具有显著时间效应和剂量效应,重组溶瘤腺病毒对Hela细胞抑制率依次为:Ad-VTAd-TAd-Vp3Ad-Mock;通过Hoechst染色和AnnexinⅤ-FITC/PI流式检测明确重组溶瘤腺病毒通过诱导Hela细胞凋亡对其产生抑制作用,且4种重组溶瘤腺病毒诱导Hela细胞凋亡的能力依次为:Ad-VTAd-TAd-Vp3Ad-Mock;通过Transwell小室迁移实验和Biocoat小室侵袭实验确定重组溶瘤腺病毒能够影响Hela细胞迁移和侵袭能力,且影响程度依次为:Ad-VTAd-TAd-Vp3Ad-Mock;通过Western Blot法检测凋亡相关蛋白明确重组溶瘤腺病毒能够影响多种Hela细胞凋亡途径蛋白,从而对Hela细胞的凋亡起调控作用。3通过JC-1染色明确重组溶瘤腺病毒可以使Hela细胞线粒体膜电位降低,诱导Hela细胞发生早期凋亡,通过JC-1流式明确重组溶瘤腺病毒诱导Hela细胞早期凋亡具有显著的时间效应,且4种重组溶瘤腺病毒诱导Hela细胞早期凋亡的能力依次为:Ad-VTAd-TAd-Vp3Ad-Mock;通过ATP和活性氧检测明确重组溶瘤腺病毒对Hela细胞线粒体的功能活性具有显著影响;通过Western Blot法初步明确重组溶瘤腺病毒通过调控AIF、Arts等线粒体凋亡途径相关蛋白诱导Hela细胞凋亡。结论:重组溶瘤腺病毒能够通过诱导Hela细胞凋亡对其起抑制作用;并且它可以通过多种途径诱导Hela细胞发生凋亡;其中最重要的途径是线粒体途径,重组溶瘤腺病毒通过影响线粒体凋亡途径相关蛋白的表达调控Hela细胞凋亡。
【图文】：

药大学 2019 届硕士学位论文文献综述腺病毒简介瘤腺病毒为无包膜病毒，一般具有二十面体衣壳结构，腺病毒由图主要衣壳蛋白和 4 种次要衣壳蛋白组成。六邻体蛋白是腺病毒中最白，包含十二面体病毒衣壳的 20 个面。如图 1 所示，在每个顶点体蛋白基底，纤维蛋白从中伸出。纤维蛋白由三个结构域组成，分，作用是将蛋白质锚定在衣壳上；远端球状旋钮区，作用是识别并；纤维轴区，作用是使旋钮远离衣壳，从而避免病毒与细胞相互作排斥作用。

图 2 细胞凋亡通路Fig.2 Cell apoptotic pathway粒体凋亡途径启动细胞凋亡的内在信号传导途径涉及多种非受体介导的刺激，，这些刺且直接作用于细胞内靶标,产生细胞内信号，对细胞进行正向或负向刺激能够引起线粒体内膜的变化,导致线粒体通透性转换（MPT）孔的开线粒体跨膜电位的丧失和两组主要促凋亡蛋白从线粒体膜间隙释放到[118]。第一组促凋亡蛋白由细胞色 C，Smac / DIABLO 和丝氨酸蛋白酶 i 组成[119,120]。这些促凋亡蛋白可以激活 caspase 依赖型线粒体途径。细 结合并激活 Apaf-1 以及 caspase-9 前体，形成“凋亡小体”[121,122]。据报c / DIABLO 和 HtrA2 / Omi 通过抑制凋亡蛋白抑制剂（IAP）活性来促
【学位授予单位】：长春中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33

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本文编号：2611477