卵泡微环境中外泌体对体外受精-胚胎移植（IVF-ET）妊娠结局的影响

发布时间：2020-04-08 11:46

【摘要】：目的研究卵泡微环境中外泌体对体外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠结局的的影响,明确卵泡微环境中外泌体的来源。方法选取200例就诊于宁夏医科大学生殖中心仅因输卵管因素行IVF的卵巢功能正常的年轻不孕患者,根据患者的妊娠结局分为两组,即妊娠组和未妊娠组。收集临床、实验室数据,比较两组之间的AMH、FSH、FSH/LH、AFC、MⅡ卵率、受精率和优胚率,并收集两组患者的卵泡液,通过ExoQuick试剂盒分离出外泌体,在透射电镜和扫描电镜下观察其形态,采用Nanosight LM 10(Malvern)检测卵泡液中外泌体的浓度,利用2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法检测外泌体的蛋白浓度;采用Western blot检测外泌体表面标志物CD9、CD63和CD81;通过PCR检测外泌体GDF9、BMP15的表达,从而明确外泌体的来源。采用多变量偏相关分析及logistic回归分析评估AMH、FSH、FSH/LH、AFC、获卵数及外泌体浓度对优胚率及妊娠结局的预测价值。结果病历资料分析结果显示,两组研究对象的血清AMH、FSH、LH、FSH/LH、AFC水平在统计学意义上没有差异(P0.05);妊娠组的MⅡ卵率、受精率和优胚率高于未妊娠组(P0.05);在电镜下观察到两组研究对象的外泌体呈圆形或椭圆形膜性囊泡结构;Nanosight LM 10(Malvern)检测结果显示:未妊娠组外泌体平均颗粒浓度为2.93±1.55×10~(10)颗粒/mL,妊娠组为4.09±2.11×10~(10)颗粒/mL。两组患者卵泡液中外泌体颗粒浓度差异有统计学意义(P0.05);BCA法显示妊娠组外泌体样本的蛋白表达强度高于未妊娠组(P0.05),Western blot结果显示两组患者的外泌体均表达其表面特异性标志物CD9、CD63和CD81,且含同浓度蛋白的情况下,妊娠组的外泌体CD9、CD63和CD81表达明显高于未妊娠组。PCR表明两组研究对象的外泌体均表达卵子的标志物GDF9、BMP15。基础FSH(r=0.17,P=0.017)及卵泡液中外泌体浓度(r=0.881,P=0.00)是影响优胚率的独立因素,基础AFC(B=0.107 P=0.033)及卵泡液中外泌体的浓度(B=0.419 P=0.00)是影响妊娠结局的独立因素。结论:卵泡液中外泌体浓度是影响妊娠结局的独立因素;发育后期卵泡中的外泌体可能来源于卵细胞。
【图文】：

宁夏医科大学硕士学位论文 结果1.2. 电镜观察外泌体形态外泌体已经被证明存在于卵泡液中，为了使外泌体可视化，采用透射电镜观察卵泡液中外泌体的形态，结果显示两组卵泡液中的外泌体均呈脂质双层膜包围的直径为30-100nm 的圆形或类圆形小体（图 1A、B），可单个分布，也可聚集成群，，其内可见低电子密度物质。对照组 PBS 中没有球形膜结构（图 1C）。在相同的五个视野中计数外泌体并计算平均数，妊娠组外泌体数量为 20±1.58 个/视野，未妊娠组外泌体数量为15±1.43 个/视野，妊娠组高于未妊娠组（P＜0.05）。为了进一步观察卵母细胞膜上的外泌体，采用扫描电子显微镜（SEM）观察卵母细胞的超微结构，结果显示在卵母细胞膜上可以观察到直径 30-100nm 的球形膜结构（图 1D-F）。

图 2 卵泡液中外泌体的颗粒浓度1.3. BCA 蛋白定量通过 BCA 蛋白定量，得到妊娠组卵泡液中外泌体的蛋白浓度平均数为：3.43 ±0.58μg/μL，未妊娠组卵泡液外泌体的蛋白浓度平均数为 2.94 ± 0.46μg/μL，妊娠组的外泌体蛋白浓度高于未妊娠组（P＜0.01，图 3A）。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714.8

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本文编号：2619300