卵巢癌分子分型的预后研究及KIAA0101在浆液性卵巢癌中的调控机制研究

发布时间：2020-04-08 13:20

【摘要】：背景与目的卵巢癌是三大女性生殖系统恶性肿瘤之一,其病死率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢癌发病隐匿,早期无明显的临床症状,大约75%的患者就诊时己属晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)。浆液性卵巢癌是卵巢恶性肿瘤中最常见的亚型,生长速度快,易早期发生腹腔转移,治疗后易产生化疗耐药。卵巢癌患者经过系统全面的肿瘤细胞减灭术和铂类、紫杉醇联合化疗,达到完全缓解或部分缓解后,仍时时面临复发、转移或死亡的危险,其5年存活率仅在30%左右。卵巢癌预后差的根本原因在于缺乏有效的早期诊断手段和预后检测指标,且卵巢癌发生发展的分子机制仍不明确。预测卵巢癌临床预后,寻找卵巢癌早期筛查的特异性标志物和新的卵巢癌治疗靶点是目前卵巢癌研究的重点和难点,将有利于卵巢癌的早期诊断和临床治疗,从而改善预后,降低病死率。根据癌症基因组图谱研究网络,对HGSOC进行分子分型,可分为四种亚型:免疫反应性,增殖性,分化性和间质性。免疫反应性亚型主要包括T细胞趋化因子配体和受体,如CXCL11,CXCL10和CXCR3。增殖性亚型的主要代表性分子为HMGA2,SOX11,MCM2,PCNA。分化性亚型主要包括MUC1,MUC16,SLPI。间质性亚型主要有HOX,FAP,ANGPTL2,ANGPTL1。通过基因表达谱分析卵巢癌的分子分型与临床和病理特征有关。在临床上,大多数患者属于免疫反应性,增殖性和分化性等亚型,间质性亚型患者偏少。文献研究显示不同的亚型预后不同,本课题组期待利用多种亚型相结合,以大量HGSOC患者的组织芯片(TMA)为载体,通过免疫组织化学的方法,旨在构建合适的数学模型,对卵巢癌患者预后进行评估,指导临床治疗。本课题组通过分子分型研究,发现不同亚型的卵巢癌其预后有所不同,增殖亚型在预后中发挥的作用尤其显著。PCNA作为卵巢癌增殖亚型的重要代表性分子,可与P15pPA(即KIAA0101)的保守的PCNA结合位点特异性结合。同时,课题组利用基因表达谱测序技术和蛋白质质谱测序技术相结合,发现KIAA0101在浆液性卵巢癌中的表达高于正常输卵管伞中的表达,并且KIAA0101在浆液性卵巢癌中的表达与预后相关,即KIAA0101高表达患者预后差,低表达患者预后好。KIAA0101主要参与DNA修复损伤,细胞增殖和细胞周期进程等。文献报道KIAA0101在胃癌,食管癌,乳腺癌,肾细胞癌和肝细胞癌中发挥癌基因的作用,并且KIAA0101过表达具有预后意义。根据高通量测序结果和既往文献研究,我们猜想,KIAA0101可能在浆液性卵巢癌中发挥癌基因的作用,且与患者预后相关。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K/AKT/mTOR通路是一个重要的细胞内信号级联反应途径。该信号通路参与细胞周期调控、细胞增殖、细胞凋亡和细胞自噬等重要生理过程。其异常活化与细胞转化,肿瘤发生,肿瘤进展和化疗耐药有关。PI3K/AKT/mTOR信号通路是包括卵巢癌在内的许多人类恶性肿瘤信号传导途径中失控最严重的信号通路之一。PI3K/AKT/mTOR通路在卵巢癌中经常被激活,在卵巢癌的发展中发挥关键作用,且与卵巢癌的不良预后密切相关。本课题主要探讨卵巢癌分子分型与预后的关系,研究亚型标志物对预后的影响,将不同亚型的标志物结合,构建数学模型,预测预后,指导临床治疗。选取增殖亚型代表性分子PCNA的结合分子一KIAA0101,详细研究其在卵巢癌中的调控作用机制。本课题研究主要从以下3个部分进行阐述:第一部分:卵巢癌分子分型的预后研究第二部分:KIAA0101促进浆液性卵巢癌增殖、转移及分子机制研究第三部分:KIAA0101促进浆液性卵巢癌化疗耐药及分子机制研究第一部分:卵巢癌分子分型的预后研究背景和目的:上皮性卵巢癌是妇科恶性肿瘤中致死率最高的癌症,很大程度上归因于大多数患者就诊时已属晚期。近70%的上皮性卵巢癌为HGSOC。目前缺乏卵巢癌早期诊断的有效筛查方法。目前尚没有可以精确预测HGSOC临床结局的特异性标志物。根据癌症基因组图谱研究网络,对HGSOC进行分子分型,可分为如下4种亚型:免疫反应性,增殖性,分化性和间质性。CXCL11为免疫反应亚型的代表,CXCL11可以与CXCR3受体结合。CXCL11高表达与非小细胞肺癌,结直肠癌,肾细胞癌,胃腺癌等不良预后相关,目前CXCL11在HGSOC中尚无研究。HMGA2是增殖亚型的代表。HMGA2是高迁移率A组蛋白质家族的成员,是一种原癌基因,参与细胞生长,分化,凋亡和肿瘤发生。HMGA2在多种人类肿瘤发病中发挥重要作用。MUC16属于分化亚型的代表,CA125是MUC16蛋白的重复肽表位,是监测卵巢癌的重要生物标志物。MUC16可能促进上皮性卵巢癌的发生发展。MUC16表达与卵巢癌预后之间的关系存在争议。本研究利用组织芯片(TMA),对HGSOC的分子分型进行免疫组织化学染色,并对染色结果进行定量分析,判断各亚型在HGSOC中的预后效果;通过亚型之间的联系,联合分析多个蛋白的免疫组化结果,建立一种可用于评估HGSOC临床结局的蛋白模型。材料和方法:利用本课题组制作的3个TMA,对CXCL11,HMGA2,MUC16进行免疫组化染色,根据染色情况,划分为低表达组和高表达组,汇总HGSOC患者的临床信息,分析CXCL11,HMGA2,MUC16表达情况与预后的关系。利用单因素和多因素Cox比例风险回归分析来评估生物标志物表达与临床结果之间的关联。根据CXCL11,HMGA2,MUC16的免疫组化和预后之间的关联,将3个指标相互联合,设计一种可用于预后判断的准确性高的蛋白模型。结果:1.HGSOC不同分子分型的免疫组织化学染色3种分型代表性分子的免疫组化染色结果分四种不同强度的染色:无染色,弱染色,中等染色和强染色,其中无染色和弱染色为分子低表达,中等染色和强染色为分子高表达。CXCL11和MUC16表现为细胞质着色,HMGA2主要表现为细胞核着色。2.3个标记物对HGSOC预后的预测价值CXCL11在HGSOC中的表达显著高于其在输卵管伞中的表达。CXCL11高表达组总生存时间短,低表达组总生存时间长。HMGA2在HGSOC中的表达显著高于输卵管伞。HMGA2高表达组总生存时间和无进展生存时间明显低于HMGA2低表达组。MUC16表达与预后无关。3.推导基于临床预后结局的双蛋白模型根据免疫组化结果,将CXCL11和HMGA2联合,建立双蛋白模型,用于预测HGSOC的预后。结果显示该双蛋白分子模型是HGSOC的总生存期和无进展生存期的独立预测因子。4.双蛋白预测模型的预测效能为了检测双蛋白预测模型的预测效能,课题组比较了 CXCL11,HMGA2和双蛋白模型对预后预测的敏感度,特异度和曲线下面积(AUC)。双蛋白模型预后预测的敏感度和特异度分别为75.00%和64.50%(P = 0.002),AUC为0.694,CXCL11与HMGA2双蛋白模型对HGSOC预后具有较大的预测价值。结论:1.CXCL11在HGSOC中高表达,且与预后相关;HMGA2在HGSOC中高表达,且与预后相关;MUC16与HGSOC预后无关。2.CXCL11和HMGA2双蛋白模型是HGSOC不良预后的独立危险因素。3.CXCL11和HMGA2双蛋白模型有望用于临床,判断HGSOC预后,指导临床治疗。第二部分:KIAA0101促进浆液性卵巢癌增殖、转移及分子机制研究背景和目的:卵巢癌是危害全世界女性健康的妇科恶性肿瘤之一,病死率高,预后差,这与卵巢癌细胞生长迅速,侵袭能力强、易早期转移密切相关。本课题研究的分子KIAA0101是与DNA损伤修复,细胞增殖密切相关的分子。已有报道KIAA0101在多种恶性肿瘤中发挥作用,但其在浆液性卵巢癌中的作用及机制尚未明确。卵巢癌TCGA数据库分析发现约87%的浆液性卵巢癌病例存在FOXM1通路的异常激活,本课题组前期的表达谱芯片结果也显示FOXM1在浆液性卵巢癌中高表达。FOXM1可以促进恶性转化,参与肿瘤的发生发展,促进肿瘤增殖、侵袭转移等多个过程。文献研究证明FOXM1在浆液性卵巢癌的增殖和转移中发挥重要作用。FOXM1为重要的转录因子,可以转录调控下游一系列重要基因的表达。通过CHIP-seq联合生物信息学分析,KIAA0101为FOXM1的下游靶基因,但FOXM1对KIAA0101具体的调控方式,调控位点尚不清楚。本研究主要通过对大量临床标本的KIAA0101的免疫组织化学染色结果进行统计,分析KIAA0101表达与预后的关系,在卵巢癌细胞系中敲低或过表达KIAAO101,研究卵巢癌细胞增殖、转移能力的变化。本研究还通过luciferase,rescue等探究FOXM1调控KIAA0101增殖和转移的具体机制。材料和方法:分别收集浆液性卵巢癌组织(SOC)和良性疾病患者正常输卵管伞组织(FT),使用RT-qPCR、western blot检测SOC和FT中KIAA0101的表达。利用本实验室制作的3个组织芯片(TMA),进行KIAA0101免疫组织化学染色,检测KIAA0101在FT和SOC中的表达及KIAA0101表达与SOC预后的关系。选择多个卵巢癌细胞系(A2780,H08910,SKOV3),构建KIAA0101的过表达质粒和干扰质粒,利用慢病毒包装系统感染卵巢癌细胞系,使其低表达或者过表达KIAA0101基因,筛建出稳定细胞系。利用MTT法检测细胞系的生长速度,利用平板克隆技术检测细胞系的克隆形成能力,利用流式细胞仪检测细胞周期分布。利用western blot对细胞周期相关蛋白进行测定。利用划痕实验检测细胞创伤后的愈合能力,利用transwell小室检测卵巢癌细胞系的迁移和侵袭能力,探究KIAA0101对卵巢癌细胞转移能力的影响。利用westemblot对EMT相关蛋白进行测定。利用免疫荧光技术,对FOXM1和KIAA0101的细胞内定位进行研究,观察两者在细胞内的位置。利用免疫组化的方法,对TMA患者依次进行FOXM1和KIAA0101免疫组化染色,根据免疫组化结果,进行四格表卡方检验,分析两者的表达相关性。利用KMplotter分析FOXM1在大样本卵巢癌中的预后情况。使用FOXM1的小干扰RNA下调卵巢癌细胞系A2780,H08910和SKOV3中的FOXM1,提RNA和蛋白,进行RT-qPCR和w评6816blot实验,检测FOXM1下调后KIAA0101表达变化情况。利用生物信息学手段,分析TCGA数据库中FOXM1和KIAA0101的mRNA的相关性,进一步验证FOXM1对KIAA0101的调控。利用Ensembl查询KIAA0101的启动子序列,利用Gene Regulation联合文献报道预测FOXM1对KIAA0101潜在的调控序列和位点。将KIAA0101的启动子扩增并克隆到pGL4.26中以产生野生型(WT)启动子。对于突变型(MT)质粒,使用重叠延伸PCR构建。本研究构建了三个经典突变和一个非经典突变(ACHR)。使用Dual-Glo荧光素酶测定系统测量萤光素酶活性并进行统计分析。利用挽救实验,观察FOXMI下调是否能恢复KIAA0101上调引起的表型变化,进一步验证FOXM1对KIAA0101的调控。结果:1.KIAA0101在浆液性卵巢癌中表达高于正常对照组且与浆液性卵巢癌患者的预后相关KIAA0101在卵巢癌中高表达:RT-qPCR检测发现KIAA0101mRNA在浆液性卵巢癌中表达显著高于正常对照中表达。Western blot和免疫组化检测发现KIAA0101蛋白在浆液性卵巢癌中表达均显著高于在正常对照中表达。KIAA0101的表达与卵巢癌病人的预后相关:根据免疫组化染色结果,将KIAA0101的表达分为两组,高表达组和低表达组;KIAA0101高表达组预后较KIAA0101低表达组差;KIAA0101高表达组浆液性卵巢癌患者术后2年和5年生存时间均短于KIAA0101低表达组患者;KIAA0101的表达还与FIGO分期相关。2.KIAA0101增强浆液性卵巢癌细胞的增殖能力卵巢癌细胞系高表达KIAA0101后,MTT检测显示生长速度加快,平板克隆提示细胞系克隆形成能力增强。KIAA0101敲除后的卵巢癌细胞系中,细胞生长速度减慢,克隆形成能力降低。KIAA0101的表达可影响卵巢癌细胞的细胞周期分布,利用腺苷对KIAA0101敲低的A2780细胞系进行双阻断,使两组细胞同步化,再进行释放,分别释放Oh,2h,3h和6h,找到KIAA0101发挥作用的时相,结果显示KIAA0101敲低会引起A2780细胞系G1/S期阻滞。细胞增殖及细胞周期相关蛋白的western blot结果提示:KIAA0101干扰后,CCNA2,CCNB1,CCND1,CCNE1表达下调,P27和P21表达上调;KIAA0101过表达后,结果相反。3.KIAA0101增强浆液性卵巢癌细胞的浸润转移能力KIAA0101过表达后,transwell小室显示卵巢癌细胞的迁移和侵袭速度加快;KIAA0101干扰后,transwell小室显示卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力降低,且划痕实验的创伤愈合时间显著延长或者不愈合;western blot显示KIAA0101调控上皮间质转化(EMT)的发生,具体表现为KIAA0101过表达后上皮性标志物E-cad 下调,间质性标志物 N-cad,ZEB1,MMP2,MMP9,Snail 等上调;KIAA0101敲减后,上皮性标志物升高,间质性标志物降低。4.FOXM1调控KIAAO101的表达免疫荧光共定位显示FOXMI和KIAA010I均定位于细胞核中。对116例HGSOC患者的免疫组化分析结果显示,FOXM1与KIAA0101表达具有一定的相关性。TCGA数据库分析示FOXM1与KIAA0101在TCGA卵巢癌中的表具有相关性。用FOXM1小干扰RNA转染卵巢癌细胞系H08910和SKOV3后,FOXMI的mRNA和蛋白水平显著下降,同时KIAA0101的mRNA和蛋白表达水平也明显降低。5.FOXM1转录激活KIAA0101的启动子从而调控其表达我们扩增了 3段含有FOXM1潜在的结合位点的启动子序列,依次为5'转录起始位点上方:544bp(-712/-169),519bp(-2244/-1726),496bp(-2700/-2205)连接到PGL4.26质粒上。荧光素酶报告系统显示这3个区域中只有496bp(-2700/-2205)被FOXM1激活。利用重叠PCR对496bp(-2700/-2205)的4个可能的结合位点进行突变,荧光素酶报告系统显示只有-2370bp位点突变后荧光素活性显著降低,即-2370bp是FOXM1转录激活KIAA0101的结合位点。6.FOXM1下调可以挽救KIAA0101过表达在浆液性卵巢癌中的促进作用在KIAA0101过表达的卵巢癌细胞系中,瞬转FOXM1的小干扰RNA,平板克隆实验显示KIAA0101上调引起的细胞增殖能力增强的表型可以被FOXMI的小干扰所消除;transwell小室显示FOX]M1干扰可以挽救KIAA0101过表达引起的卵巢癌细胞的迁移、浸润能力的改变。相反,KIAA0101小干扰RNA可以消除部分FOXM1过表达引起的卵巢癌细胞增殖、迁移、浸润能力的变化。结论:1.KIAA0101在浆液性卵巢癌的表达显著高于正常输卵管伞的表达,且其高表达提示预后差。2.KIAA0101促进浆液性卵巢癌的增殖能力和转移能力。3.FOXM1通过转录调控KIAA0101从而促进其增殖和转移能力。第三部分:KIAA0101促进浆液性卵巢癌化疗耐药及分子机制研究背景和目的:肿瘤细胞减灭术联合顺铂、紫杉醇化疗是卵巢癌的标准治疗方案,但过去的几十年,卵巢癌患者的5年存活率一直徘徊在30%左右,主要由于卵巢癌细胞易产生原发性或继发性化疗耐药,病情缓解后易复发。文献报道KIAA0101与肝癌的阿霉素耐药和食管癌的顺铂耐药相关,目前尚不明确KIAA0101在浆液性卵巢癌化疗耐药中是否发挥作用。PI3K/AKT/mTOR通路在卵巢癌中通常存在异常激活,具体机制未明。自噬是细胞内重要的代谢途径,与肿瘤的发生发展存在一定的关系,目前KIAA0101与细胞自噬方面的研究较少。本研究深入探讨KIAA0101对PI3K/AKT/mTOR通路及细胞自噬的影响。此外,本研究利用数据库己有的大规模数据进行共表达分析,构建KIAA0101调控的下游分子网络。KIAA0101的化疗耐药及分子机制研究为KIAA0101在浆液性卵巢癌中的作用提供重要的参考价值。材料和方法:对卵巢癌细胞施加一定浓度梯度的顺铂刺激,利用western blot观察KIAA0101的表达是否随着加药浓度的改变而发生相应变化。给细胞顺铂刺激后,观察KIAA0101敲除后卵巢癌细胞形态的变化。利用MTT检测KIAA0101干扰或者过表达对卵巢癌细胞顺铂化疗的影响。利用平板克隆形成实验检测KIAA0101干扰对卵巢癌细胞顺铂刺激的影响。检测KIAA0101是否调控PI3K/AKT/mTOR通路。观察KIAA0101是否影响卵巢癌细胞的自噬和凋亡。利用流式细胞仪检测顺铂加药后卵巢癌细胞凋亡率的改变,利用激光共聚焦显微镜观察KIAA0101对卵巢癌细胞系自噬能力的影响。此外,利用western blot对细胞凋亡和自噬的相关指标进行测定,凋亡方面,分析PARP,Cleaved PARP,Caspase 9,Cleaved caspase9,Caspase7,Cleaved caspase7,Bax 和 Bc12 等的变化趋势;自噬方面,分析 Atg16L1,Atgl2,Atg7,Atg5,Beclinl,P62,LC3 等的改变。最后,利用共表达分析,寻找KIAA0101可能调控的下游分子,并利用western blot进行初步验证。结果:1.KIAA0101增强浆液性卵巢癌细胞的顺铂耐药能力对A2780,HO8910,SKOV3细胞施加顺铂刺激后,western blot显示随着加药浓度的增加,KIAA0101表达升高。加药MTT发现,KIAA0101过表达的细胞系对顺铂更加耐受,其半数致死量(IC50)显著高于正常对照细胞,KIAA0101敲低后,结果相反。给细胞施加顺铂刺激后,观察细胞形态的改变,结果显示KIAA0101干扰后的细胞对化疗药物更加敏感,趋向于凋亡。耐药平板克隆显示,KIAA0101敲低后,给予梯度浓度的顺铂刺激,随着顺铂浓度的增加,其克隆形成能力显著下降。2.KIAA0101 激活 PI3K/AKT/mTOR 通路KIAA0101过表达后,western blot显示磷酸化的PI3K,AKT,mTOR均上调,KIAA0101干扰后,磷酸化的PI3K,AKT,mTOR均下调。该通路激活后抑制细胞凋亡和自噬,促进卵巢癌化疗耐药。3.KIAA0101抑制顺铂介导的浆液性卵巢癌细胞的凋亡KIAA0101 过表达后,western blot 结果显不 CleavedPARP,Cleaved caspase 9,Cleaved caspase7,Bax降低,Bcl2升高,细胞凋亡显著抑制,KIAA0101敲除后,促凋亡蛋白Bax升高,抗凋亡蛋白Bcl-2降低,凋亡相关蛋白Cleaved PARP,Cleaved caspase 9,Cleavedcaspase7均升高。流式细胞仪检测顺铂加药的HO8910细胞凋亡率,敲除KIAA0101的HO8910细胞更易发生凋亡。4.KIAA0101抑制浆液性卵巢癌细胞的自噬利用免疫荧光探究KIAA0101对自噬的影响,KIAA0101敲除后,激光共聚焦显微镜显示自噬小体增加,卵巢癌细胞自噬增强。自噬相关蛋白的western blot结果显示,KIAA0101过表达后,自噬相关蛋白Atgl6L1,Atgl2,Atg7,Atg5,Beclinl,LC3表达下调,P62表达上调,即KIAA0101过表达抑制卵巢癌细胞的自噬,KIAA0101敲除促进卵巢癌细胞的自噬。5.KIAA0101可以调控下游一系列重要分子的表达利用公共数据库GEPIA和Oncomine进行共表达分析,挑选其中相关系数高的 9 个重要分子:KIF23,PCNA,PRC1,CDC25C,UBE2C,TOP2A,Rad51,KIF20A和Aurora A。在干卵巢癌细胞系A2780和HO8910中,分别干扰和过表达KIAA0101,利用western blot进行验证,寻找KIAA0101调控的下游分子网络。结论:1.KIAA0101激活PI3K/AKT/mTOR通路,抑制顺铂介导的肿瘤细胞的凋亡和自噬,促进顺铂化疗耐药。2.KIAA0101调控一系列下游重要基因的表达,如KIF23,PCNA,PRC1,CDC25C,UBE2C,TOP2A,Rad51,KIF20A 和 Aurora A。
【图文】：

预后,生存时间,患者

图２．邋ＣＸＣＬｌｌ，邋ＨＭＧＡ２，邋ＭＵＣ１６的预后－总生存期分析逡逑（Ａ）邋ＣＸＣＬ１１总生存时间的Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ图，ＣＸＣＬ１１高表达提示ＨＧＳＯＣ不逡逑良预后，，主要表现为总生存时间缩短。（Ｂ）邋ＨＭＧＡ２总生存时间的Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ逡逑图，ＨＭＧＡ２高表达的ＨＧＳＯＣ患者总生存时间较低表达患者短。（Ｃ）邋ＭＵＣ１６总逡逑生存时间的Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ图，ＭＵＣ１６表达高低与ＨＧＳＯＣ的总生存T间无明显逡逑关系。逡逑

预后,生存时间

图３．ＣＸＣＬ１１，邋ＨＭＧＡ２，邋ＭＵＣ１６的预后－无进展生存期分析逡逑（Ａ）ＣＸＣＬｌｌ无进展生存时间的Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ图，ＣＸＣＬ１１高表达提示ＨＧＳＯＣ逡逑无进展生存时间较短，但是差别没有统计学意义。（Ｂ）邋ＨＭＧＡ２无进展生存时间逡逑的Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ图，ＨＭＧＡ２高表达与疾病复发进展相关，ＨＭＧＡ２高表达的逡逑ＨＧＳＯＣ患者无进展生存时间较低表达患者短。（Ｃ）邋ＭＵＣ１６无进展生存时间的逡逑Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ图，ＭＵＣ１６表达高低与ＨＧＳＯＣ的无进展生存时间无明显关系。逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31

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