通过抑制Bcl-2激活SIRT3调控线粒体分裂增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性

发布时间：2020-04-08 16:54

【摘要】：研究背景:卵巢癌是一种严重威胁全球女性生命健康的常见恶性肿瘤,目前卵巢癌的主要治疗方法包括外科手术治疗和以铂药为核心的化学药物治疗,而长期应用化疗药物引起的耐药严重限制了其治疗效果。因此,迫切需要研究卵巢癌细胞对铂类药物的耐药机制,寻找提高卵巢癌细胞对化疗药物敏感性的有效方法。已有研究发现,顺铂可以通过靶向损伤肿瘤细胞线粒体功能产生细胞杀伤作用。但当应用顺铂时,肿瘤细胞将产生一系列线粒体质量控制来抵抗顺铂的细胞毒性。最近,越来越多的证据表明,Bcl-2家族与线粒体功能调控密切相关,其参与调控线粒体自噬、细胞凋亡以及线粒体分裂与融合的动态过程,是线粒体质量控制的关键因子。在细胞凋亡过程中,通过抑制Bcl-2家族抗凋亡蛋白介导的线粒体融合,Bcl-2家族促凋亡蛋白BAX和BAK过表达可促进线粒体分裂。然而,Bcl-2家族蛋白质如何在分子水平上影响线粒体动力学的机制尚不明确。Bcl-2家族蛋白可通过许多通路调控线粒体质量,其中包括参与调节线粒体功能的SIRT3蛋白通路。SIRT3是NAD~+依赖性组蛋白去乙酰化酶家族的成员之一,近年来因其在肿瘤遗传学、衰老、神经退行性疾病中的作用备受关注,在生理状态下SIRT3定位于细胞核与线粒体,当细胞处于应激状态或当SIRT3表达增加时,SIRT3会从细胞核转移至线粒体。并且据文献报道,SIRT3在沉默Bcl-2介导的细胞凋亡过程中不可或缺,换言之SIRT3是Bcl-2调控细胞凋亡的重要介质。鉴于SIRT3和Bcl-2家族蛋白在调节线粒体功能中发挥重要的调节作用,我们尝试探讨SIRT3是否参与调节与Bcl-2家族蛋白功能相关的线粒体功能障碍。实验目的:卵巢癌预后不良主要是由化疗耐药引起的。越来越多的研究表明,Bcl-2家族蛋白与肿瘤及线粒体动力学的分裂/融合调控之间存在一定关系,且参与肿瘤的耐药机制。然而,Bcl-2家组蛋白通过调节卵巢癌细胞的线粒体功能增加对顺铂敏感性的具体机制仍不清楚。SIRT3作为组蛋白脱乙酰酶,参与肿瘤中线粒体功能的调节,沉默而Bcl-2家族蛋白诱导的凋亡需要SIRT3的参与。在本研究中,我们旨在探讨SIRT3与ABT737和顺铂在卵巢癌细胞中诱导的线粒体功能障碍之间的机制联系。实验方法:Annexin V/PI染色后流式细胞仪检测细胞凋亡。使用SIRT3脱乙酰酶荧光测定法评估SIRT3活性。在JC-1染色后通过流式细胞术检查线粒体膜电位。通过蛋白质印迹分析证实SIRT3的过表达和敲低以及细胞凋亡。通过免疫荧光染色或蛋白质印迹分析检测线粒体裂变/融合动力学。实验结果:确定了Bcl-2抑制剂ABT737可以通过调控Bcl-2家族蛋白表达水平,导致线粒体膜电势去极化,最终导致卵巢癌细胞线粒体途径凋亡;SIRT3的过度激活通过线粒体途径促进SKOV3细胞凋亡,特异性敲减SIRT3可部分逆转顺铂联合ABT737对线粒体膜电势的影响,SIRT3是ABT737增强SKOV3卵巢癌细胞顺铂敏感性的关键分子,并且SIRT3的表达量与活性均对该过程有影响;顺铂联合ABT737对线粒体融合无明显作用,ABT737联合顺铂促进了DRP1从胞浆转位进入线粒体,从而导致线粒体的分裂。SIRT3的激活增加了线粒体中DRP1的定位,而胞浆中DRP1的定位减少了,提示SIRT3的激活使DRP1由胞浆转位进入线粒体,进而可能促进线粒体的分裂。实验结论:应用Bcl-2的小分子抑制剂ABT737联合顺铂,SIRT3的表达上调并且活性升高,可能促进了SKOV3卵巢癌细胞的线粒体分裂,最终导致线粒体途径凋亡,从而提高其对顺铂的敏感性,为逆转肿瘤细胞顺铂耐药提供新的方法和思路。
【图文】：

图 1.1 卵巢癌的分类及治疗现状B 细胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族蛋白是调控凋亡过程的主要因其可分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白[17-19]，如图 1.2。与正常细胞相比，Bcl-2 家族在许多肿瘤中均呈高表达[20]。此外，Bcl-2 家族抗凋亡成员如 Bcl-2、Mcl-1、Bcl-x过表达可增强多种肿瘤细胞对顺铂的耐药性[11]。因此，Bcl-2 被认为是癌症治疗的靶研究显示，采用小分子抑制剂可干扰 Bcl-2 和促凋亡组分之间的相互作用，从而起肿瘤的干扰与抑制[21]。通过核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）筛选，ABT737 是一种强效的抗凋亡蛋白抑制剂，主要抑制 Bcl-2，Bcl-xL 和 Bcl-w，具同细胞毒性，并在各种癌症类型中诱导大量细胞凋亡，包括卵巢癌，胆管癌和肺癌相关机制研究表明，ABT737 是通过调节凋亡信号实现其功能，而不是直接启动凋程[23]。

图 1.2 Bcl-2 家族蛋白分类近年来，越来越多的证据表明 Bcl-2 家族蛋白与癌症及线粒体动力学的分裂/融合调控之间存在一定联系[24,25]。Bcl-2 家族的促凋亡成员通过抑制 Bcl-2 等抗凋亡蛋白介导的线粒体融合，促进线粒体的分裂[26]。此外，其他研究表明，BAX 和 BAK 蛋白的过表达也可诱导线粒体分裂[27]。综上所述，这些结果显示 Bcl-2 家族在线粒体动力学调控中发挥作用。然而，，Bcl-2 家族蛋白影响线粒体动力学的具体分子机制尚不清楚。SIRT3 是 SIRTuin 家族的一员，在哺乳动物中主要分布于线粒体，作为一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的组蛋白去乙酰化酶，其参与活性氧（Reactive oxygenspecies，ROS）的清除和线粒体正常功能的调节[28,29]。据报道，山奈酚（Kaempferol）可通过降低 Bcl-2 和增加 SIRT3 诱导细胞凋亡。同时，可以观察到 SIRT3 定位于线粒体，提示 SIRT3 在线粒体凋亡通路中发挥作用[30]。最近的研究指出，沉默 Bcl-2 诱导的凋亡需要 SIRT3 的参与，这意味着 SIRT3 可能是 Bcl-2 调控凋亡过程中必不可少的
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.31

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本文编号：2619595