CRISPR-Cas9对HPV58阳性宫颈癌C33A细胞的基因编辑与治疗的实验研究

发布时间：2020-04-08 17:38

【摘要】：研究背景宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一。根据2018年全球癌症统计报告推算,2018年全球女性宫颈癌新发病例数为57万例,死亡病例数为31.1万例,发病病例和死亡比例在女性全身恶性肿瘤中均排在第四位。在中国,每年新增宫颈癌病例约14万例,死亡病例约3.7万例。目前公认的导致宫颈癌发生发展的主要危险因素是高危型人类乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)的持续感染。从最初的HPV感染到宫颈癌的发生需要大约10-20年的时间,这意味着宫颈癌的发生是一个多因素相关的复杂过程。大多数宫颈癌是由HPV16和HPV18感染导致的。在我国,HPV58是继HPV16、18之后的导致宫颈癌的第三重要型别,且近年来感染率有升高趋势。近20年来,宫颈癌的5年生存率没有变化,所有目前的治疗策略(放疗、化疗、手术)在疗效上己经趋于平稳,这些治疗策略对正常细胞苛刻,对宫颈恶性组织的靶向性不够。有效预防HPV病毒感染的积极措施为接种HPV疫苗,但是当前的疫苗既不能预防所有类型的HPV感染,也不能治疗已经存在的病变。在研究HPV致病机制的基础上,如何有效清除HPV感染及控制HPV的致病能力,一直是宫颈癌防治的关键环节。当前亟需一种有效的治疗HPV感染发病的方法及一种新型的更有效的宫颈癌治疗方式。20世纪80年代末到90年代初,研究人员在细菌和古细菌基因组中观察到一种脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA)序列,被称为规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat squences,CRISPR)。随着研究的进展,人们认识到CRISPR-CRISPR相关序列(CRISPR-Associated Squences,Cas)系统是细菌和古细菌中一种获得性免疫系统,通过引导RNA(guide RNA,gRNA)介导,Cas酶特异性的切割外源遗传物质,用以对抗入侵的病毒和质粒。基因的异常表达导致很多人类疾病的发生。CRISPR-Cas9系统可以对高等生物的细胞基因组DNA精准高效的编辑,因此在各种人类疾病的基因治疗方面已展现出广阔的应用前景。CRISPR-Cas9系统对于清除生物体内的病毒感染是一种非常有效的方法。到目前为止比如乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)与肝癌、EB 病毒(Epstein-Barr virus,EBV)与Burkitt淋巴瘤和鼻咽癌、人类疱疹病毒与卡波西肉瘤及HPV与宫颈癌等的研究。当前,CRISPR-Cas9基因编辑技术主要应用于HPV16、18相关宫颈癌基因治疗的研究,但尚未有应用于HPV58相关宫颈癌治疗的报道。本课题拟研究CRISPR-Cas9系统在HPV58阳性宫颈癌细胞及组织中的基因编辑及治疗,具体研究内容包括以下两部分:第一部分:CRISPR-Cas9系统在HPV58阳性宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响及其机制的实验研究研究目的:研究CRISPR-Cas9系统在HPV58阳性宫颈癌C33A细胞(C33A/LV-HPV58E6E7)靶向失活E6、E7基因及抑制癌细胞增殖和促进凋亡的分子机制,并验证CRISPR-Cas9系统是否可被发展成为抑制HPV58感染及相关宫颈癌的新一代基因治疗技术。研究方法:1.利用双gRNA法(成对的gRNA/Cas9 D10A策略),设计并合成了四对不同的gRNA序列,并将它们分别酶连入载体pAIO-mCherry的相应表达框中,从而构建出可分别针对HPV58 E6、E7两个基因的CRISPR-Cas9系统的表达质粒 pAIO-mCherry/gRNAI、和 pAIO-mCherry/gRNA2、pAIO-mCherry/gRNA3 和pAIO-mCherry/gRNA4,并分别进行Sanger测序验证。2.使用T7核酸内切酶I(T7 EI)酶切试验,验证CRISPR-Cas9系统在目标基因组上的切割效率。选出具有Cas9切割效率的靶点片段,测序并分析结果。3.将CRISPR-Cas9系统的表达质粒转染入稳定表达HPV58型E6E7融合基因的人C33A宫颈癌细胞系(C33A/LV-HPV58E6E7)中。4.分别利用Westem-Blot检测、CCK-8增殖实验、AnnexinV-FITC/PI染色及流式细胞术实验检测CRISPR-Cas9系统对C33A/LV-HPV58E6E7细胞系E6、E7、p53、pRb蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响。研究结果:1.T7核酸内切酶I(T7EI)测定CRISPR-Cas9/gRNA切割效率:通过T7核酸内切酶I(T7EI)酶切试验,结果表明我们构建的CRISPR-Cas9系统可以成功且高效地对细胞基因靶点片段进行切割和编辑,其中Cas/gRNA1的切割率为 41.5%,Cas/gRNA2 的切割率为 54.6%,Cas/gRNA3 的切割率为 62.4%,Cas/gRNA4的切割率为49.7%。2.CRISPR-Cas9 系统可引起 C33A/LV-HPV58E6E7 细胞中 E6、E7 表达抑制,相应的 p53、pRb 蛋白上调:经 Cas/gRNA1、Cas/gRNA2、Cas/gRNA3、Cas/gRNA4质粒分别转染48小时后的C33A和C33A/LV-HPV58 E6E7细胞。Western-Blot检测细胞中E6、E7、p53和pRb蛋白的表达结果显示Cas/gRNA1、Cas/gRNA2可抑制C33A/LV-HPV58E6E7细胞E6基因表达,对E7基因表达不影响,相应的引起p53蛋白的增加;Cas/gRNA3、Cas/gRNA4可抑制C33A/LV-HPV58E6E7细胞E7基因表达,对E6基因表达不影响,相应的引起pRb蛋白的增加。3.CRISPR-Cas9系统抑制C33A/LV-HPV58E6E7肿瘤细胞增殖生长:对转染了Cas/gRNA1、Cas/gRNA2、Cas/gRNA3、Cas/gRNA4 的 C33A/LV-HPV58E6E7细胞以及C33A/HPV58和C33A细胞进行CCK-8细胞增殖实验检测。结果显示,CRISPR-Cas9系统分别有效地减缓C33A/HPV58+gRNA1、C33A/HPV58+gRNA2、C33A/HPV58+gRNA3 和 C33A/HPV58+gRNA4 的细胞OD值增长,即CRISPR-Cas9系统可以抑制C33A/LV-HPV58E6E7细胞的增殖活力,并从监测第一天开始可以一直维持到第5天。而仅仅转染了空白质粒载体的C33A细胞的增殖速率却不受CRISPR-Cas9系统的影响。同时,结果也表明HPV58对C33A肿瘤细胞的生长起促进作用。4.CRISPR-Cas9系统促进C33A/LV-HPV58E6E7肿瘤细胞凋亡:分别用Cas9/gRNA1、Cas9/gRNA2、Cas9/gRNA3、Cas9/gRNA4 处理 C33A/LV-HPV58 E6E7肿瘤细胞和C33A肿瘤细胞。流式细胞术检测结果显示C33A/LV-HPV58E6E7细胞在Cas9/gRNA处理后均显示凋亡率急剧增加。Cas9gRNAl、Cas9gRNA2 导致 C33A/LV-HPV58E6E7 细胞凋亡率达 60%,Cas9gRNA3、Cas9gRNA4 导致 C33A/LV-HPV58E6E7 细胞凋亡率达 40-50%。而 Cas9/gRNA处理后对C33A细胞的细胞凋亡率与空白组基本一致,没有明显的变化。研究结论:1.双gRNA法构建的CRISPR-Cas9系统,可以对HPV58肿瘤细胞基因组精确及有效地进行切割,是一种高效便捷的基因敲除技术。2.CRISPR-Cas9 系统可引起 C33A/LV-HPV58E6E7 细胞中 E6、E7 表达抑制,p53、pRb蛋白上调,并抑制C33A/LV-HPV58E6E7细胞的增殖活力,促进C33A/LV-HPV58E6E7细胞凋亡。CR1SPR-Cas9系统未来可以被开发成为辅助治疗HPV58感染及相关宫颈癌的一种基因治疗技术。第二部分:PBAE和Micelle与CRISPR-Cas9质粒合成纳米药物用于治疗HPV58相关宫颈癌的实验研究研究目的:验证基于聚β-氨基酯(Polybeta amino ester,PBAE)纳米颗粒和F127/PPO-NMe3/pCas9纳米胶束(Micelle)与CRISPR-Cas9质粒合成的新型纳米药物,能否成为治疗HPV58感染及相关宫颈癌的一种新型小分子靶向基因药物。研究方法:1.分别合成PBAE及纳米颗粒和制备Micelle纳米胶束,对其表征进行鉴定。2.将PBAE纳米颗粒及Micelle纳米胶束分别与CRISPR-Cas9系统的表达质粒合成纳米药物。将纳米药物分别作用HPV58阳性新鲜宫颈癌组织及C33A/LV-HPV58E6E7 细胞系。3.利用Western-Blot检测HPV58阳性宫颈癌组织中E6、E7、p53、pRb蛋白的表达变化,利用CCK-8增殖实验检测对C33A/LV-HPV58E6E7细胞系增殖影响。研究结果:1.新型纳米药物作用C33A/LV-HPV58E6E7细胞系后,可抑制C33A/LV-HPV58E6E7细胞生长:使用PBAE和Micelle制成的纳米颗粒分别与 Cas9/gRNAl、Cas9/gRNA2、Cas9/gRNA3、Cas9/gRNA4 功能质粒结合并分别作用C33A/LV-HPV58E6E7细胞系后,CCK-8细胞增殖实验检测显示C33A/LV-HPV58E6E7细胞的增殖活力均受到明显抑制,这种趋势从监测第1天就已经比较明显并可以一直维持到第5天。而C33A细胞的增殖速率却不受CRISPR-Cas9系统的影响。2.新型纳米药物作用于HPV58阳性宫颈癌组织,可抑制细胞中E6、E7表达,相应的p53、pRb蛋白上调:使用PBAE和Micelle制成的纳米颗粒分别与 Cas9/gRNAl、Cas9/gRNA2、Cas9/gRNA3、Cas9/gRNA4 功能质粒结合并作用上述两例HPV58阳性宫颈癌组织,Western Blot检测显示gRNA1、gRNA2可抑制细胞E6基因表达,相应的引起p53蛋白的增加;gRNA3、gRNA4可抑制C33A/LV-HPV58E6E7细胞E7基因表达,相应的引起pRb蛋白的增加。研究结论:使用PBAE纳米颗粒和Micelle纳米胶束做为药物载体,可输送CRISPR-Cas9质粒至细胞内,通过抑制HPV58阳性宫颈癌细胞中E6、E7表达,上调p53、pRb蛋白,可抑制C33A/LV-HPV58E6E7细胞的增殖活力,有望成为治疗HPV58感染及相关宫颈癌的新型小分子靶向基因药物。
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山东大学博士学位论文逡逑理如图１所示：在ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ基因座上游会表达反式激活ＲＮＡ邋（ｔｒａｎｓ－逡逑ａｃｔｉｖａｔｉｎｇＲＮＡ，邋ｔｒａｃｒＲＮＡ）邋；邋ｔｒａｃｒＲＮＡ邋会参与邋ＣＲＪＳＰＲ邋相关的邋ＲＮＡＣＣＲＩＳＰＲ－逡逑ｄｅｒｉｖｅｄＲＮＡ，ｃｒＲＮＡ）的加工；Ｃａｓ９是一种内切酶，其具有ＲｕｖＣ和ＨＮＨ两逡逑个内切酶活性中心。ｔｒａｃｒＲＮＡ５’端的序列和ｃｒＲＮＡ３’端的保守序列通过碱基互逡逑补配对形成个杂交分子，，这个杂交分子通过其特殊的空间结构和Ｃａｓ９蛋Ａ相互逡逑结合形成一个蛋白－ＲＮＡ复合物，该复合物引导Ｃａｓ９蛋白在与ｃｒＲＮＡ配对的序逡逑列靶位点通过其两个内切酶活性中心分别切断双链ＤＮＡ，其中ＨＮＨ切断与逡逑ｃｒＲＮＡ互补的一条链，ＲｕｖＣ切断非互补链，从而造成双链ＤＮＡ断裂（ＤＮＡ逡逑ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ邋ｂｒｅａｋ，ＤＳＢ）邋［３３］。利用邋ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９邋系统的特性，可用于基因敲逡逑除、基因修复、基因调控、文库筛选及基因型鉴定等［３３＿３７］。已有研究报道

图２．邋ｐＡＩＯ＿ｍＣｈｅｒｒｙ酶切位点图逡逑Ｆｉｇ．２邋ｐＡＩＯ＿ｍＣｈｅｎ＊ｙ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｃｕｔｔｉｎｇ邋ｓｉｔｅ邋ｍａｐ逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33


本文编号：2619635