人卵巢颗粒细胞线粒体年龄相关性改变及调控机制的初步研究

发布时间：2020-04-12 03:03

【摘要】：研究背景及目的:高龄女性的生育问题是目前所面临的重大社会需求,随着女性年龄增加其生育能力逐渐下降,辅助生殖技术的临床妊娠结局变差,其原因主要在于卵泡数量减少或卵母细胞质量下降。鉴于颗粒细胞(granulosa cells,GCs)与卵母细胞在组织结构及功能上密切关联,同时,线粒体,做为细胞供能及代谢调控的重要结构对确保GCs的正常功能状态有着重要意义。因此,本研究通过建立稳定的人卵巢壁层颗粒细胞(mural granulosa cells,mGCs)分离、培养体系,研究mGCs线粒体的年龄相关性改变,进一步探索高龄相关的GCs线粒体功能减退过程中的调控机制,为改善高龄女性GCs线粒体功能寻找新的研究靶点。方法:1.采用密度梯度离心法从辅助生殖过程中获取的废弃卵泡液中分离mGCs,台盼蓝染色检测细胞活力,流式细胞仪鉴定细胞纯度,透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)观察细胞超微结构,并采用免疫组化染色、免疫荧光染色鉴定 mGCs 促卵泡生成素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)的特异性表达,CCK-8法检测mGCs细胞的增殖活性。2.采用TEM对比分析高龄组(≥38岁)与对照组(38岁)患者mGCs线粒体的超微结构,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR)检测线粒体 DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)拷贝数、4977-bp大片段缺失比例、ATP5A1、ATP5I及3-羟基异丁酸脱氢酶(3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase,HIBADH)mRNA 的表达水平,流式细胞仪、荧光显微镜等检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)、细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)、ATP 水平,Western blot 检测氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)复合体蛋白的表达。3.采用 Western blot 检测高龄组与对照组患者mGCs中HIBADH蛋白表达,在人卵巢颗粒细胞系(KGN细胞)中,采用Western blot分别检测沉默、过表达HIBADH基因后OXPHOS复合体蛋白、HIBADH蛋白的表达,利用多功能酶标仪检测处理后KGN细胞中ROS、ATP、MMP水平。结果:1.体外分离所得mGCs细胞存活率90%,白细胞污染率6.73%,FSHR阳性表达率99%,并于体外培养第3天达到增殖高峰。2.对照组(38岁)mGCs线粒体多呈圆形或椭圆形,含管状或囊状嵴,基质密度均一,高龄组多见细长形线粒体,富含嵴结构及高密度基质颗粒,且异常线粒体显著增多;mtDNA拷贝数与年龄呈正相关,未检出4977-bp片段缺失mtDNA;高龄组mGCs MMP、ATP水平较对照组显著降低,ROS在两组间未见统计学差异;ATP5A1蛋白、mRNA及HIBADH mRNA表达水平随年龄增加而降低且HIBADH mRNA表达水平与ATP51A及ATP5I mRNA表达水平呈正向直线相关。3.HIBADH蛋白表达在mGCs中随着年龄的增加而降低,在KGN细胞中,细胞增殖活性、ATP含量及OXPHOS复合体蛋白Ⅳ-MTCO1、V-ATP5A1蛋白表达水平随着HIBADH基因的过表达而增加,随HIBADH基因沉默而降低。结论:1.建立并优化了人卵巢mGCs分离、体外培养及鉴定体系。2.mGCs线粒体功能随年龄增加减退,其中氧化磷酸化功能减退是主要表现。3.HIBADH基因在调控人卵巢GCs线粒体氧化磷酸化功能的过程中发挥重要作用。
【图文】：

２．４．１．２人卵巢ｍＧＣｓ计数及存活率检测逡逑（１）吸取上述单细胞悬液１０逦采用细胞计数板于光学显微镜下计数，细胞逡逑密度（个／ｍＬ）＝（细胞计数板四角４个大方格细胞总数／４）邋ｘｌ0４。计数板如图１－１所逡逑／」、？邋０逡逑Ｉ邋Ｏｍｍ邋ｔ邋＾邋１邋ｕ邋ｍｍ逡逑ｊｊｊ邋r>邋Ｔｉｊ邋｜｜｜邋ｊｊｙ逡逑Ｂｉ＾逦Ｈ邋棚邋ＩＩＫ￥逡逑｜逦二４二ｆ＿率—：率ｇ逦二ｋ逡逑逦ａ逦■■—Ｉ逦：二封逦二去逡逑逦逦邋－－－－０邋２邋ｍｍ邋Ｊ逡逑１邋ｉ邋ｆ邋１１邋ｊｉｉｆ邋Ｈｉ邋ｉｊｊ邋１邋｜邋｜逡逑［邋ｕ邋ｕ邋0＂ｘ）邋Ｉ邋，邋，ｉ逦＿＿ｕ－．！？Ｊ＿邋：－邋：：；邋ｌ！ｉ邋Ｉ邋－邋￣逡逑１逦１逦ｒ＾Ｖ邋ｉ逦１邋ｖＴ逡逑0：＞邋ｍｍ＊邋１邋ｊ邋Ｉ邋｛邋［＇＂Ｉ邋Ｉ邋；邋Ｉ邋Ｔ￣逡逑图１－１．细胞计数板示意图逡逑（２）单细胞悬液与０．４％台盼蓝染液以９：１混合混匀后，在３邋ｍｉｎ内计数细胞存逡逑活率，光镜下，死细胞被染成明显的蓝色，活细胞呈无色透明状。细胞存活率＝活细逡逑胞数／邋（活细胞数＋死细胞数）。逡逑２．４．１．３人卵巢ｍＧＣｓ的原代培养逡逑依据实验需要，使用ＤＭＥＭ／Ｆ１２（含１０％胎牛血清、１００Ｕ／ｍＬ青霉素和１００邋ｎｇ／ｍＬ逡逑链霉素）的细胞培养液调节单细胞悬液的密度并培养细胞，，将其接种在细胞培养板或逡逑已放置细胞爬片的细胞培养皿中，置于３７°Ｃ邋５％Ｃ０２细胞培养箱中培养，每２４ｈ于逡逑倒置显微镜下观察细胞的体外生长情况

图１－２．人卵巢ｍＧＣｓ第１－９天体外生长情况０２００）逦．逡逑注：在培养第１天后细胞贴壁，细胞多呈梭形、星形等不规则形态，细胞与细胞间通过伪足相连接，高倍镜下观察细胞核大，圆形且核仁明显，细胞质中颗粒丰富（Ｄ１）。约在培养第３天殖达到高峰，细胞聚集成团（Ｄ３），随后至第６天，细胞伪足张力逐渐减低，呈成纤维细胞形改变（Ｄ６）。在培养第７天至第９天，培养液中死亡漂浮的细胞逐渐增多，可见细胞轮廓逐渐糊，细胞与细胞间伪足逐渐消失，高倍镜下可见细胞质中颗粒量逐渐减少，细胞整体状态呈老、退化的现象（Ｄ７－９）。逡逑３．２邋人卵巢ｍＧＣｓ纯度、特异性及增殖特性的鉴定逡逑３．２．１流式细胞术鉴定细胞纯度逡逑ＣＤ４５广泛表达于白细胞表面，而在人卵巢ｍＧＣｓ中表达阴性，采用流式细仪检测分离所得ｍＧＣｓ邋ＣＤ４５＋细胞的比例，用来评估本研究分离方法中白细胞对标细胞的污染率，从而鉴定细胞纯度，共独立检测１０份标本，ＣＤ４５＋细胞的比
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R711

【参考文献】

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本文编号：2624196