染色体倍性及胚胎质量与线粒体DNA拷贝数的关系探究

发布时间：2020-04-12 02:02

【摘要】：背景与目的线粒体是细胞中最丰富的细胞器,参与细胞能量产生、细胞信号传导、钙离子内环境平衡、细胞凋亡等各种关键性的细胞活动,在卵母细胞的成熟、受精以及早期胚胎的发育过程中发挥重要作用。线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)可以独立进行复制、转录和翻译,可从亲代到子代稳定遗传。卵母细胞和精子中均含有一定数量的线粒体DNA。卵母细胞与精子相遇并受精,很短的一段时间后精子中的线粒体即被降解。因此,胚胎中的线粒体及线粒体DNA几乎全部来自于卵母细胞。研究表明非整倍体胚胎的线粒体DNA水平比整倍体高,且线粒体DNA拷贝数与母体生育年龄和胚胎非整倍性均相关联,线粒体DNA拷贝数可作为临床上预测植入前囊胚染色体是否异常的标志。目前已经提出,在胚胎发育的最初阶段会出现线粒体增殖,来适应胚胎发育的起始和代谢的变化。因此,异常或种植潜力较差胚胎的线粒体DNA水平增加或提前复制增殖可能是一个识别胚胎应激和发育异常的标志,这种现象是线粒体应对不良外界环境做出的代偿性反应。但是,有研究组运用线粒体DNA标准化测量方法后,发现线粒体DNA与年龄、倍性及植入潜能并无较深入的关系,其预测价值有所降低。本实验的目的在于,研究染色体倍性及胚胎质量与胚胎线粒体DNA拷贝数之间的关系,以探究染色体倍性异常的囊胚线粒体DNA是否有提前复制增殖的现象,评估线粒体DNA拷贝数可否作为判断囊胚质量的指标。材料和方法分别用孤雌激活技术构建单倍体胚胎、显微胞浆内精子注射技术构建三倍体胚胎、细胞融合技术制作四倍体胚胎,同时运用相应技术构建二倍体胚胎作为对照组;药物(STZ)诱导法构建糖尿病小鼠模型、体外延时培养以获得老化卵子,正常健康小鼠来源的卵子为对照组,与相同来源及密度的精子混合进行体外受精与胚胎培养。对上述各模型所得囊胚应用实时荧光定量聚合酶链反应技术(Real Time qPCR)中绝对定量PCR的方法检测线粒体DNA拷贝数。每组数据均重复三次以上。实验数据中计量资料以x±s(均数±标准差)表示,两组间比较采用t检验;多组间比较采用方差分析;计数资料以百分数表示,采用卡方检验;P0.05为差异有统计学意义。结果1对孤雌激活(单倍体组)、ICSI操作(三倍体组)及受精(四倍体组)后96 h及120 h形成的囊胚收样,简称96 h囊胚和120 h囊胚。两种非二倍体囊胚线粒体DNA拷贝数与分别相应二倍体囊胚对照组相比并无显著统计学差异(96h囊胚:单倍体:P=0.4291,三倍体:P=0.6001,四倍体:P=0.5325;120 h囊胚:单倍体:P=0.3005,三倍体:P=0.6073,四倍体:P=0.9767)。2无论是单倍体、二倍体、三倍体还是四倍体,96 h囊胚与120 h囊胚线粒体DNA拷贝数均无明显差异(单倍体:P=0.7791;三倍体:P=0.8456;四倍体:P=0.7113)。3大部分单倍体、三倍体的发育速度均比对照组二倍体发育速度慢。4随着染色体倍性的增加,同时期囊胚的细胞数逐渐减少(单倍体∶二倍体=60.09±2.61∶48.88±2.37;三倍体∶二倍体=29.00±2.46∶42.43±3.04;四倍体∶二倍体=21.77±1.52∶44.46±1.90),而且细胞体积逐渐增大。5对于质量较差的糖尿病小鼠囊胚,其线粒体DNA拷贝数是明显增加的,有统计学差异(P=0.0062)。体外老化卵子来源的囊胚,其线粒体DNA数量也显著高于正常(P=0.0092)。结论1线粒体DNA拷贝数与胚胎染色体倍性无必然联系。2质量较差的胚胎线粒体DNA拷贝数升高,因此线粒体DNA拷贝数可能作为判断胚胎质量的参考指标。
【图文】：

囊胚,倍性

所得不同倍性的囊胚中随机选取部分进行了染色体铺片和染色。经过秋水仙素同步化的囊胚细胞（包括内细胞团和滋养层细胞）大多处于有丝分裂中期，因此染色体可以以较明显的形态展现。如图1.1所示，分别显示了单倍体（图1.1A）、二倍体（图 1.1 B）、三倍体（图 1.1 C）和四倍体（图 1.1 D）囊胚中一个细胞所有染色体的状态。经鉴定，，染色体条数均符合。图 1.1 囊胚倍性的鉴定。（A）单倍体；（B）二倍体；（C）三倍体；（D）四倍体。

囊胚发育,染色体倍性,囊胚

图 1.2 囊胚发育速度与染色体倍性关系A 拷贝数与囊胚染色体倍性的关系激活单倍体及二倍体囊胚、卵胞浆内精子注射三倍体及二胎电融合所成四倍体囊胚及其相应对照组二倍体胚胎，分别
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.8

【参考文献】