共载紫杉醇及microRNA-7纳米载药递送系统的构建及其抗卵巢癌作用的研究

发布时间：2020-04-12 18:34

【摘要】：紫杉醇(paclitaxe,PTX)联合铂类药物为卵巢癌的一线化疗方案。化疗诱导的肿瘤细胞信号通路激活与耐药相关。对化疗的敏感性与晚期卵巢癌患者生存期密切相关。因此,降低耐药发生,提高化疗敏感性对卵巢癌的治疗十分重要。MicroRNAs是一类约含22个碱基的内源性非编码小RNA,参与许多信号通路分子的转录后调控。化疗与基因治疗的联合将为卵巢癌的治疗开拓新的途径。研究目的本课题旨在通过纳米载药系统,联合PTX及microRNA-7(miR-7),减轻化疗毒副作用,提高化疗的敏感性。研究内容1.构建共载PTX及miR-7的mPEG-PLGA-PLL纳米粒(P/MNPs)并表征。2.探讨P/MNPs在卵巢癌细胞中的摄取、转染效率及疗效,并探索miR-7增敏PTX的机制。3.探讨P/MNPs在小鼠卵巢癌模型中的生物分布、疗效及转染效率,并验证miR-7增敏PTX的机制。研究方法采用复乳法制备共载PTX及miR-7的mPEG-PLGA-PLL纳米粒(P/MNPs),用正交实验探索优化制备条件及PTX比例。通过琼脂糖凝胶电泳探索miR-7的适宜比例。利用粒度仪对纳米粒的粒径及电位进行测定,透射电镜观察纳米粒形态。高效液相色谱分析测定PTX浓度,荧光分光光度计测定miR-7浓度。采用离心法分离检测PTX包封率,透析法模拟PTX释放,采用超滤离心法分离检测miR-7包封率及释放。采用CCK-8法测定纳米粒毒性及IC_(50)值,通过荧光显微镜观察细胞对纳米粒的摄取,应用溶酶体染料观察纳米粒的溶酶体逃逸,qRT-PCR检测miR-7的转染效率,流式细胞仪检测细胞的凋亡比例。采用Western blot方法检测经PTX处理后卵巢癌细胞的耐药蛋白及重要信号通路的蛋白表达变化,并探索miR-7增加PTX敏感性的作用机制。构建裸鼠卵巢癌皮下异种移植瘤模型,小动物活体成像仪观察纳米粒的生物学分布,冰冻切片检测瘤体内纳米粒分布。应用小鼠卵巢癌皮下瘤模型研究P/MNPs的疗效,监测肿瘤大小及体重变化,收集小鼠全血及血清进行血常规及肝肾功能检查,采用HE染色对小鼠心肝脾肺肾脏器进行病理形态观察。通过TUNEL实验检测肿瘤内的细胞凋亡比例,qRT-PCR检肿瘤内miR-7的表达水平,采用免疫组化法检测肿瘤EGFR蛋白表达变化。研究结果经正交实验优化P/MNPs的制作工艺后,纳米粒粒径为105.0±0.86 nm,分散系数(Polydispersity index,PDI)为0.276±0.007,Zeta电位为19.0±2.04 mV,紫杉醇的包封率为84.1±1.31%,miR-7的包封率为98.3±0.21%。纳米粒形态呈圆形,分散较好,在血清中对RNA有保护作用。P/MNPs中PTX及miR-7具有缓释特性,前24h内以PTX释放为主,24h以后miR-7开始加速释放,两种药物的释放存在一定的时间差,持续释放72h以上。空载mPEG-PLGA-PLL纳米粒无明显细胞毒性。纳米粒相比游离药物能更好的被细胞摄取,并呈时间依赖性。纳米粒被摄取后能够从溶酶体中逃逸发挥作用。纳米粒转染细胞24及48h后,能够将细胞内miR-7水平分别提高15倍及40倍以上。P/MNPs的IC_(50)相比游离药物明显降低,48h的IC_(50)为2.85±0.45 ng/mL,72h的IC_(50)为0.41±0.03 ng/mL。P/MNPs诱导肿瘤细胞凋亡的能力明显增强,48h及72h细胞的凋亡比例分别为45.4±1.17%及72.7±2.99%。Western blot结果显示PTX可能引起卵巢癌细胞EGFR、ERK、p-ERK蛋白的表达增加,miR-7可抑制EGFR、ERK、p-ERK蛋白表达。动物活体成像的结果提示游离药物难以靶向肿瘤部位,P/MNPs能够在2-8h内聚集于肿瘤部位,并于24h达到高峰。瘤体冰冻切片显示纳米粒能够成功的将两种药物同时运载至肿瘤部位。体内疗效实验显示P/MNPs组皮下瘤体平均重量为82.3±10.1 mg,相同用药浓度下疗效最好。毒性实验结果提示P/MNPs组小鼠的白细胞、中性粒细胞数量相比游离药物组有恢复,且肝功能中ALT及AST也有所下降。P/MNPs组小鼠心肝脾肺肾脏器HE染色未见明显病理改变。小鼠肿瘤TUNEL实验结果提示,P/MNPs组平均凋亡比例为10.7±1.87%,与游离药物组及单药纳米粒组差异均具有统计学意义。瘤体qRT-PCR结果显示,P/MNPs组的miR-7表达平均增加了21.2±6.76倍,与游离药物组比较差异具有统计学意义。瘤体免疫组化的结果提示,游离PTX组的EGFR蛋白表达明显增加,P/MNPs组的EGFR蛋白表达明显减少,表明miR-7能抑制EGFR的表达。结论成功制备的共载PTX及miR-7的mPEG-PLGA-PLL纳米载药递送系统(P/MNPs)粒径适宜,分散均匀,能保护RNA不被降解,易于被细胞摄取,缓慢释放,高效将miR-7转入细胞,抑制由于PTX而被激活的与耐药相关的EGFR/ERK通路,增加肿瘤细胞对PTX的敏感性。P/MNPs在体内实验中能通过EPR效应靶向肿瘤部位,增加肿瘤miR-7表达,抑制EGFR表达,促进肿瘤细胞凋亡,增强化疗药物抑瘤效果,并且无明显的毒副作用,在卵巢癌治疗中具有潜在的应用价值。
【图文】：

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上海交通大学医学院博士学位论文5图1 共载紫杉醇及miR-7的mPEG-PLGA-PLL纳米载药递送系统作用机制示意图Figure1 A schematic diagram explaining the mechanism of mPEG-PLGA-PLL nanoparticles co-delivered with paclitaxel and microRNA-7本课题的研究内容主要包括以下三个部分：第一部分，，构建共载紫杉醇及miR-7的mPEG-PLGA-PLL纳米粒。探究紫杉醇、miR-7与材料mPEG-PLGA-PLL的适当比例，优化纳米粒制作工艺。对纳米粒进行粒径大小、电荷、形态的表征，对药物的释放进行评估。第二部分，将成功构建的共载紫杉醇及miR-7的mPEG-PLGA-PLL纳米粒作用于卵巢癌细胞。检测空载纳米粒的细胞毒性、卵巢癌细胞对纳米粒的摄取、纳米粒的转染效率以及对紫杉醇的增敏效果。探索紫杉醇作用于卵巢癌细胞后细胞通路的改变，探究miR-7增加PTX敏感性的机制。第三部分，在第二部分的研究基础上进行小鼠体内实验。利用小鼠卵巢癌皮下瘤模型检测mPEG-PLGA-PLL纳米粒的体内靶向性。利用小鼠卵巢癌皮下瘤模型再次验证共载纳米粒的疗效并同时检测纳米粒的体内毒性，并对纳米粒的转染效率进行体内验证

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[36]。图2 共载紫杉醇及miRNA的mPEG-PLGA-PLL纳米粒示意图Figure 2 Schematic illustration of mPEG-PLGA-PLL nanoparticles co-delivered withpaclitaxel and microRNA所以本研究使用mPEG-PLGA-PLL共同包载紫杉醇和miR-7，采用多种方法对其进行表征以期达到合适粒径、形态、包封率，验证纳米粒对RNA的保护作用，评价药物释放，为后续实验奠定坚实基础（图2）。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31

【参考文献】