羟喜树碱对外源野生型p53转染的宫颈癌细胞的作用效果

发布时间：2020-04-13 18:17

【摘要】：背景子宫颈癌是全球女性中常见的恶性肿瘤之一。目前治疗宫颈癌方法主要包括手术和放化疗,但都未达到理想的治疗效果,尤其是宫颈癌中晚期患者,预后较差。p53作为一种最常见的抑癌基因,在肿瘤的发生发展中起重要作用,由于其在子宫颈癌组织中表达水平较低,使得p53基因在子宫颈癌的基因治疗方面有着重要的潜力。因此,利用转入技术将高表达抑癌基因p53结合传统化疗方法极有可能在宫颈癌的治疗中具有广泛的应用价值。羟喜树碱(hydroxycamptothecin,HCPT)作为一种植物类抗癌药物已广泛应用于胃癌、肝癌、骨肉瘤等许多恶性肿瘤的治疗中,疗效较好,但羟喜树碱对宫颈癌的抑制作用研究较少。如果将两者结合,可能会明显提高宫颈癌的治疗效率,从而为临床上宫颈癌的治疗提供新的研究方向。目的将外源野生型p53基因导入宫颈癌HeLa、SiHa细胞中,探讨HCPT对已经转染外源野生型p53基因的宫颈癌细胞体外生长、凋亡作用的影响。方法1.细胞培养常规将宫颈癌HeLa、SiHa细胞复苏和培养。2.转染将宫颈癌细胞分为3组:(1)空白对照组,即正常培养的宫颈癌HeLa、SiHa细胞;(2)阴性对照组,即将空质粒导入宫颈癌HeLa、SiHa细胞;(3)实验组,即将携带外源野生型p53基因的质粒导入宫颈癌HeLa、SiHa细胞。3.检测转染效率将转染过的两组细胞培养48h后,采用荧光显微镜通过蓝光激发绿光来观察转染效率。然后提取总RNA,并采用qRT-PCR检测两种细胞中p53的表达水平,以hACTB基因为内参,来验证p53基因转染效率的高低。4.将HCPT加入各组细胞后,检测宫颈癌细胞增殖率、凋亡率、及相关蛋白的表达量(1)采用CCK-8法检测p53基因真核载体及阴性对照瞬时转染HeLa、SiHa细胞后,用不同浓度的HCPT处理转染后的各组细胞,未转染正常细胞作为对照。(2)采用流式细胞技术检测其对细胞凋亡率的变化。(3)应用qRT-PCR法检测p53、bax、bcl-2、MMP9、VEGF mRNA的表达。(4)应用Western blot检测p53、bax、bcl-2、MMP9、VEGF蛋白相对表达量。结果1.荧光显微镜和qRT-PCR检测显示:导入宫颈癌中的p53目的质粒转染效率高,且转染后p53 mRNA表达水平显著提高。2.CCK-8结果显示:不同浓度HCPT处理转染后宫颈癌HeLa、SiHa细胞,两种细胞抑制率会随着HCPT浓度增加及作用时间的延长而增强,与空白对照组比较差异具有统计学意义(P0.05),说明HCPT可抑制宫颈癌HeLa、SiHa细胞的增殖,且呈浓度和时间剂量依赖性。3.流式细胞技术结果显示:HCPT组、p53组、p53联合HCPT组与空白对照组比较,细胞凋亡率明显增加,各组间两两比较差异均具有统计学意义(P0.05)。4.qRT-PCR结果显示:在转染后的宫颈癌Hela、SiHa细胞中p53及bax mRNA表达是增高的,而bcl-2、VEGF mRNA表达是降低的,具有统计学意义(P0.05)。5.Western-blot结果显示:在宫颈癌Hela、SiHa细胞中p53及bax蛋白的相对表达量均增高,而bcl-2、VEGF的相对表达量是降低的,具有统计学意义(P0.05)。结论外源野生型p53基因导入宫颈癌HeLa和SiHa细胞后,可明显增强HCPT的作用,即抑制宫颈癌细胞的增殖,促进细胞的凋亡,减少细胞生长的作用。
【图文】：

新乡医学院硕士学文论文2 结 果2.1 p53 基因导入宫颈癌 HeLa、SiHa 细胞的转染效率2.1.1 荧光显微镜观察瞬时转染 HeLa、SiHa 细胞的效率为了检测 p53 在宫颈癌 HeLa、SiHa 细胞中的转染效率，我们使用阳离子脂质体 Lipofectamin2000，转染 HeLa 细胞 48h 后，在荧光显微镜下选用蓝色激发波长，观察瞬时表达的感染细胞发绿色荧光。白光下观察转染目的质粒的细胞形态改变明显，体积变小，排列紧密，如(图 1D)所示。转染阴性对照质粒和目的质粒的 HeLa细胞可观察到绿色荧光表达量较多，排列较紧密，(图 1A 和图 1C)，说明该实验转染效率较好。

新乡医学院硕士学文论文图 B 是白光下转染阴性对照质粒 pcNDA3.1-HA-EGFP 48h 后 HeLa 细胞；图 C 是荧光下转染目的质粒 pcNDA3.1-HA-TP53 48h 后 HeLa 细胞；图 D 是白光下转染目的质粒 pcNDA3.1-HA-TP53 48h 后 HeLa 细胞。同样使用阳离子脂质体 Lipofectamin2000，转染 SiHa 细胞 48h 后，在荧光显微镜下选用蓝色激发波长，观察瞬时表达效果。白光下观察转染目的质粒的细胞形态改变明显，体积变小，排列较紧密，如(图 2D)所示。转染阴性对照质粒和目的质粒的 SiHa 细胞可观察到绿色荧光表达量较 HeLa 细胞明显减少，说明该实验转染效率明显较 HeLa 细胞低，(图 2A 和图 2C)。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.33

【参考文献】

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本文编号：2626279