妊娠期镉暴露致F1代大鼠成年后卵巢颗粒细胞损伤及其DNA甲基化模式改变

发布时间：2020-04-19 01:24

【摘要】：目的研究并阐明妊娠期镉暴露对F1代大鼠成年后卵巢颗粒细胞生长和激素合成功能的影响及其DNA甲基化模式改变,为进一步阐明镉致卵巢细颗粒细胞胞损伤及其表遗传机制提供科学依据。方法SPF级成年SD大鼠,合笼受孕后,于妊娠第1-20天分别暴露于0、0.5、2.0、8mg/kg CdCl2,灌胃染毒,每天一次。F1代雌鼠于出生后第56天时,取卵巢颗粒细胞稳定培养24h贴壁后收集细胞(10×10~6个/ml)及上清液备用。第一部分妊娠期镉暴露致F1代大鼠成年后颗粒细胞凋亡的影响(1)观察颗粒细胞亚显微结构(透射电子显微镜);(2)检测卵巢颗粒细胞凋亡率(AnnexinV-FITC/PI双染);(3)检测卵巢颗粒细胞Bcl-2、Bax、Bcl-xl、Caspase3、及Caspase8基因mRNA(RT-PCR法)和蛋白表达(Western-blot法)。第二部分妊娠期镉暴露致F1代大鼠成年后颗粒细胞激素合成的影响(1)检测颗粒细胞上清液孕酮、雌二醇水平(ELISA法);(2)检测颗粒细胞StAR、SF-1、Cyp11a1、Cyp17a1及Cyp19 a1基因mRNA(RT-PCR法)和蛋白表达(Western-blot法)第三部分F1代大鼠成年后颗粒细胞全基因组DNA启动子区甲基化研究(1)检测卵巢颗粒细胞(n=3)全基因组DNA甲基化启动子区差异基因表达谱(免疫共沉淀法);(2)差异甲基化基因GO分析;(3)差异甲基化基因KEGG信号通路分析。第四部分:根据芯片检测结果及生物信息学分析提示验证Eif2s1、Atf4启动子区DNA甲基化状态(1)启动子在线分析软件Methl Primer Express及SignalMap确定Eif2s1、Atf4基因启动子区差异峰落在CpG岛;(2)验证Eif2s1、Atf4基因启动子区甲基化状态(BSP法);(3)测定Eif2s1、Atf基因的mRNA表达水平(RT-PCR)。结果第一部分:妊娠期镉暴露致F1代大鼠成年后颗粒细胞凋亡的影响(1)与对照组相比,各染镉组出现的凋亡细胞及凋亡小体数量增加,颗粒细胞线粒体、内质网、细胞核、染色质出现不同程度损伤。(2)与对照组比,各染镉组凋亡率均升高,差异具有统计学意义(P0.01)。(3)与对照组相比,各染镉组Bcl-2、Bcl-xl及Bcl-2/Bax mRNA和蛋白表达均出现不同程度的下调,Caspase3基因mRNA差异无统计学意义,蛋白表达出现不同程度上调,差异具有统计学意义(p0.05),各染镉组Bax、Caspases8基因mRNA及蛋白表达差异均无统计学意义。第二部分:妊娠期镉暴露致F1代大鼠成年后颗粒细胞激素合成的影响(1)与对照组相比,各染镉组颗粒细胞上清孕酮水平显著性下调,差异具有统计学意义(P0.01),而雌二醇水平差异无统计学意义(P0.05)。(2)各染镉组StAR、Cyp11a1基因mRNA及蛋白表达均显著下调,差异具有统计学意义(P0.05),Cyp17a1、Cyp19a1基因mRNA及蛋白表达差异均无统计学意义(P0.05),SF-1基因mRNA表达出现不同程度改变,但蛋白差异无统计学意义(P0.05)。第三部分F1代大鼠成年后颗粒细胞全基因组DNA启动子区甲基化研究(1)与对照组相比,8.0mg/kg组基因组DNA发生低甲基化基因的数量高于发生高甲基化的基因数,且主要发生在高密度启动子和中密度启动子区。(2)GO分析提示妊娠镉暴露对F1代大鼠成年后卵巢颗粒细胞相应的生物学过程、分子功能及细胞组分产生影响。(3)差异性甲基化Pathway分析提示,与对照组相比,镉暴露对F1代大鼠颗粒细胞48条通路产生影响,其中凋亡通路中Eif2s1、Atf4等14个基因启动子区发生了高甲基化,Bcl-xl基因启动子区发生低甲基化,未见Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase8基因启动子区甲基化状态发生改变;激素合成基因Cyp1a1、Hsd17b1启动子区发生低甲基化,未见StAR、SF-1、Cyp11a1、Cyp17a1、Cyp19a1基因启动子区甲基化发生改变。第四部分根据芯片检测结果及生物信息学分析等结果提示验证Eif2s1、Atf4启动子区DNA甲基化状态(1)Eif2s1、Atf4基因启动子特定区域出现高甲基化峰,此峰落在相应基因CpG岛。(2)与对照组相比,各染镉组Eif2s1、Atf4基因mRNA表达下调,差异有统计学意义(P0.05)。(3)与对照组相比,8.0mg/kg组Eif2s1基因启动子区平均甲基化率增高,差异有统计学意义(P0.05),Atf4基因启动子区平均甲基化率差异无统计学意义(P0.05)。结论根据以上结果,可得出如下结论1.妊娠期镉暴露可致F1代大鼠成年后卵巢颗粒细胞生长和功能产生影响。2.妊娠期镉暴会改变F1代大鼠成年后颗粒细胞全基因组DNA甲基化状态,引起凋亡及激素合成相关基因甲基化模式发生改变。3.本实验条件下Eif2s1--Atf4通路被抑制,DNA甲基化可能参与其抑制Eif2s1基因mRNA表达的调控,但可能未参与其抑制Atf4基因mRNA表达的调控。
【图文】：

透射电镜,颗粒细胞,凋亡小体,线粒体肿胀

结果第一部分妊娠期镉暴露致 F1 代卵巢颗粒细胞凋亡的影响1 透射电子显微镜观察 F1 代大鼠卵巢颗粒细胞亚显微结构使用透射电镜对不同剂量体外镉暴露后大鼠卵巢颗粒细胞的亚显微结构进行观察，结果显示：如图 1.1 A 所示，对照组大鼠卵巢颗粒细胞膜完整，细胞核核膜清楚，核染色质分布均匀，，未见异染色质，线粒体丰富，其结构及线粒体清楚完整；如图 1.1B 所示，可见两个凋亡小体，凋亡小体，凋亡小体内线粒体胀，嵴稀疏；如图 1.1C 所示，细胞体积变小，细胞质浓缩，细胞核边集，染色固缩；如图 1.1D 所示，细胞体积变小，核分裂，线粒体肿胀，线粒体嵴消失，亡小体。A B

F1代,流式细胞仪分析,颗粒细胞,统计学意义

2 妊娠期镉暴露致 F1代大鼠成年后颗粒细胞激素合成的影响Annexin V-FITC/PI 双染法对各组 F1代大鼠卵巢颗粒细胞凋亡情况进行检测。如图1.2 A 所示，0、0.5、2.0和8.0 mg/ kg 大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率分别为11.35%，19.28%，22.41%，19.65%；如图1.2 B 和表1.1所示，与对照组比较，0.5、2.0和8.0 mg/ kg 细胞凋亡率差异均具有统计学意义( P＜0.01)。A0mg/kg 0.5mg/kg2.0mg/kg 8.0mg/kg
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R715.3

【参考文献】