尿道支撑组织来源外泌体在女性压力性尿失禁发病机制中的作用研究

发布时间：2020-04-20 11:06

【摘要】：研究背景压力性尿失禁(Stress Urinary Incontinence,SUI)是好发于孕产妇及中、老年妇女的慢性病,严重影响患者生活质量,被称为“社交癌”。近年来,随着二胎政策开放和人口老龄化,SUI患者数剧增,引起医学界重视;但该病发病机制欠清,缺乏理想的临床防治措施。现已公认,SUI主要由尿道支撑组织薄弱所致;进一步研究认为,成纤维细胞主导的尿道支撑组织微环境细胞外基质(Extra-cellular Matrix,ECM)重构障碍是该病发病的关键,但其具体调控机理尚未明确。外泌体是近年来备受关注的胞间通讯方式,参与多种组织局灶ECM微环境结构及功能调控;通过探讨外泌体在尿道支撑组织中的表达及其在SUI发病中的作用,有望为该病发病机制研究提供可行方向;然而,国内外文献罕见相关报道。目的本研究旨在明确尿道支撑组织局灶微环境中是否存在外泌体调控方式;阐明SUI患者是否存在尿道支撑组织外泌体异常表达;并在体外细胞水平,探讨该外泌体对尿道支撑组织成纤维细胞功能的影响。研究方法1.收集女性尿道支撑组织,分为SUI组和非SUI组,每组各8例;匹配两组间年龄、绝经时间、孕产次、分娩方式及体重指数(Body Mass Index,BMI)。2.采用沉淀法提取尿道支撑组织来源外泌体,联合电镜、纳米颗粒示踪分析技术及蛋白免疫印迹法,鉴定其形态特征、粒径分布范围及外泌体标志蛋白CD63的表达。3.采用纳米颗粒示踪分析技术及BCA蛋白定量法,检测SUI组和非SUI组尿道支撑组织来源外泌体含量,比较组间差异。4.获得女性尿道支撑组织原代成纤维细胞,共培养细胞与尿道支撑组织来源外泌体,分为F+Sexo组(成纤维细胞与SUI组尿道支撑组织来源外泌体共培养)、F+Nexo组(成纤维细胞与非SUI组尿道支撑组织来源外泌体共培养)和F组(即对照组,成纤维细胞与培养基共培养),采用CCK-8增殖实验、划痕实验、蛋白免疫印迹法及反转录酶-聚合酶链锁反应法,观察各组成纤维细胞增殖、迁移和胶原合成功能,比较组间差异。研究结果1.女性尿道支撑组织中提取到沉淀物质,透射电镜显示其形态为类圆形杯口状,蛋白免疫印迹法显示其外泌体特异性标志蛋白CD63表达呈现阳性结果,纳米颗粒示踪分析技术显示其直径主要分布于50-200nm区间,鉴定为外泌体。2.SUI组和非SUI组单位质量(g)尿道支撑组织来源外泌体蛋白含量分别为1606.02 ug 和 1216.75 ug,外泌体数量分别为 2219x10^8 个和 982 x10^8 个,SUI组外泌体蛋白含量和数量均显著高于非SUI组(p均0.05)。3.F+Sexo组成纤维细胞在24h、48h及72h时间点细胞的增殖率分别为30%、52%及 214%,F+Nexo 组分别为 16%、32%及 105%;F+Sexo 组和 F+Nexo 组各时段细胞OD值均较对照组显著增加(p均0.05),F+Sexo组各时段细胞OD值显著高于 F+Nexo 组(p均0.05)。4.24h、48h及72h的细胞划痕愈合率F+Sexo组分别为19%、26%及27%,F+Nexo组分别为38%、61%及77%,对照组分别为59%、100%及100%;经统计学分析,F+Sexo组和F+Nexo组各时段细胞划痕愈合率均显著低于对照组(p均0.05),F+Sexo组各时段细胞划痕愈合率均显著低于F+Nexo组(p均0.05)。5.F+Sexo组细胞Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA及蛋白表达水平显著高于对照组(p均0.05);F+Nexo组细胞Ⅰ型和Ⅲ型前胶原的mRNA和蛋白水平与对照组相比无统计学差异。结论1.尿道支撑组织局灶微环境存在外泌体调控方式。2.SUI组尿道支撑组织外泌体的表达量显著高于非SUI组。3.尿道支撑组织来源外泌体可能通过影响成纤维细胞增殖、迁移及胶原合成能力参与SUI发病。
【图文】：

３．２尿道支撑组织来源外泌体的提取及鉴定逡逑采用ＳＢ１沉淀技术从原代尿道支撑组织中成功提取沉淀物，透射电镜观察显示逡逑沉淀物形态为类圆形杯口状（图１Ａ），Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法显示沉淀物外泌体特异性标逡逑志蛋白ＣＤ６３呈现阳性表达（图１Ｂ），纳米颗粒示踪技术显示沉淀物直径主要分逡逑布于５０－２００ｎｍ间（图１Ｃ－Ｅ）。以上三种方法结合，证实女性尿道支撑组织中存逡逑在外泌体分布。逡逑２１逡逑

学硕士学位论文质量（ｇ）尿道支撑组织外泌体总蛋白量均值为１６０６．０２邋ｕｇ，非ＳＵＩｇ）尿道支撑组织外泌体总蛋白量均值为１２１６．７５邋ｕｇ；经Ｔ检验，两计学意义，ＳＵＩ组尿道支撑组织来源外泌体蛋白含量显著高于非．０５，，图邋２Ｄ）。逡逑Ａ逦Ｃ逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R711.59

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本文编号：2634475