GDF15对宫颈癌细胞放射敏感性及EMT作用的研究

发布时间：2020-04-25 23:36

【摘要】：目的:放射治疗是宫颈癌治疗的重要手段之一,宫颈癌细胞对放疗不敏感被认为是放疗失败的主要原因,其具体分子机制尚未完全明晰。GDF15(生长分化因子15),属于TGF-β超家族中的一员,参与多种肿瘤的发生发展进程,但其与宫颈癌放射敏感性相关的研究甚少。本研究拟通过探讨GDF15对宫颈癌细胞放射敏感性和EMT(上皮细胞-间充质转化)的影响,及其可能的作用机制,为改善宫颈癌患者的疗效提供新的靶点。方法:1、应用Western blot检测照射前后宫颈癌细胞株(Siha、Hela、Caski和C33a)中GDF15表达的变化。2、予以rh GDF15(重组人GDF15蛋白)刺激及转染质粒两种方式构建GDF15高表达模型,检测上调宫颈癌细胞GDF15的表达对其放射敏感性的影响。3、构建特异性针对GDF15基因的小干扰RNA慢病毒载体,建立GDF15低表达模型,检测下调宫颈癌细胞GDF15的表达对其放射敏感性的影响。4、应用Western blot、Real-time PCR和免疫荧光等方法检测不同GDF15表达模型中β-catenin、c-Myc的表达,探讨GDF15调控宫颈癌放射敏感性可能存在的机制。5、利用细胞划痕实验、Transwell小室和Matrigel基质侵袭实验等方法,检测不同GDF15表达水平对宫颈癌细胞EMT及EMT相关蛋白表达水平的影响。结果:1、6Gy X-ray照射24h后,不同宫颈癌细胞株(Siha、Hela、Caski和C33a)中GDF15的表达均明显升高。2、予以rh GDF15(100ng/ml)刺激和转染p EGFP-N1-GDF15质粒均可上调宫颈癌细胞中GDF15的表达,与对照组相比,GDF15高表达可使宫颈癌细胞照射后的克隆形成率明显增加。3、与亲代相比,下调GDF15的表达可使宫颈癌细胞照射后的克隆形成率明显降低、凋亡率明显增加。4、GDF15可上调宫颈癌细胞中β-catenin、c-Myc及磷酸化c-Myc的表达,而使用β-catenin抑制剂(XAV-939)和c-Myc抑制剂(10058-F4)后,可逆转高表达GDF15宫颈癌细胞株的放射抵抗。5、与亲代相比,GDF15-si RNA转染的宫颈癌细胞迁移和侵袭能力减弱,且细胞内MMP9、Vimentin和N-cadherin的表达降低,E-cadherin的表达增加。再次给予rh GDF15刺激后,细胞的迁移和侵袭能力增强,且细胞内MMP9、Vimentin和N-cadherin的表达增加,E-cadherin的表达降低。结论:1、GDF15是影响宫颈癌细胞放射敏感性的重要调控因子;2、GDF15可通过β-catenin/c-Myc通路增加宫颈癌细胞的放射耐受;3、GDF15参与宫颈癌细胞EMT表型的调控。综上所述,提示GDF15可能为逆转宫颈癌放射抵抗提供新的治疗策略。
【图文】：

颈癌细胞的放射敏感性，首先我们构建GDF15高表达模型，检测上调GDF15对宫颈癌细胞放射敏感性的影响。Western Blot结果显示，，予以rhGDF15（100ng/ml）刺激后，和对照组相比，宫颈癌细胞中GDF15的表达明显升高（如图2A所示）。构建真核表达载体pEGFP-N1-GDF15，通过脂质体介导pEGFP-N1-GDF15转染宫颈癌细胞Siha和Hela，Western Blot结果表明GDF15高表达模型构建成功（如图2B所示）。克隆形成实验结果显示，与未给予rhGDF15相比，在培养基中添加rhGDF15（100ng/ml）后，辐射后细胞克隆形成数明显增加，生存曲线显示在不同照射剂量下细胞存活明显增加（如图2C和2D所示）。与转染空白载体相比，pEGFP-N1-GDF15转染后的宫颈癌细胞Siha和Hela均呈现出明显的放射抵抗（如图2E所示）。上述结果表明，GDF15高表达状态下（予以rhGDF15刺激或pEGFP-N1-GDF15转染）

显下降（如图 3B 所示）。克隆形成实验结果显示，与对照组相比，GDF15低表达时，宫颈癌细胞辐射后细胞克隆形成数明显下降（如图3C所示）。细胞生存曲线提示，在GDF15表达下调后，宫颈癌细胞在不同照射剂量下细胞存活明显降低（如图3D所示）。流式细胞术进一步检测，转染GDF15-siRNA的Siha和Hela细胞在辐射后48小时的细胞凋亡率。结果显示，转染GDF15-siRNA的Siha和Hela细胞辐射后细胞凋亡率（早凋和晚凋的细胞比例）分别为（17.32±1.01）%、（23.56±1.42）%，和阴性对照组（4.08±0.72）%、（4.23±0.84）% 相比均明显增加，进一步提示GDF15表达下调后，Siha细
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33

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本文编号：2640823