HPV-16E7通过SIRT7调节DSB修复的作用及机制研究

发布时间：2020-04-29 14:23

【摘要】：研究背景宫颈癌作为常见的妇科肿瘤之一,严重威胁着女性的生命和健康。化疗是治疗宫颈癌的重要方法,一些化疗药物通过诱发DNA断裂损伤,杀灭肿瘤细胞。DNA双链断裂(Double strand break,DSB)损伤是最严重的DNA断裂损伤之一,肿瘤细胞对DSB损伤的修复可增强肿瘤对化疗的耐受性,造成肿瘤预后不良。高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)的持续性感染是宫颈癌主要的致病因素,其中HPV-16最为常见。HPV编码6种早期蛋白和2种晚期蛋白,其中早期蛋白E6、E7是主要的癌蛋白,参与调节宫颈上皮细胞恶性转化相关的多种生理活动,如细胞增殖,凋亡,迁移和侵袭,维持基因组稳定性。关于E7调节DNA损伤修复的研究仍存在争议,有报道发现HPV-16E7上调DNA损伤修复相关蛋白,如ATM、Chk2等的表达,从而促进DNA损伤修复。也有研究表明HPV-16E7延长细胞核内γH2AX多聚体的存在,抑制DSB损伤修复。HPV-16E7对DSB损伤修复的作用及其分子机制有待进一步探究。Sirtuin7(SIRT7),Sirtuins家族的一员,是一类NAD(+)依赖的组蛋白去乙酰化酶,它在多种生理和病理过程包括DNA损伤修复和维持基因组稳定性中都发挥重要作用。已有报道和我们的初步研究结果显示,HPV-16E7上调SIRT7表达,而SIRT7是否参与HPV-16E7对DSB损伤修复的调节还不明确。MRN(Mre11-Rad50-Nbsl)复合物在DNA复制、细胞周期调控、端粒维持和维持基因组稳定性等过程中有广泛作用,在DSB损伤过程中可以识别DNA断裂点,招募并激活修复相关蛋白ATM等。研究表明Sirtuins家族成员SIRT1可以去乙酰化修饰Nbs1从而促进MRN复合物的形成,且BioGRID数据库显示Mre11可能与SIRT7存在相互作用,因此我们推断HPV-16E7通过上调SIRT7表达,去乙酰化Mre11来影响DSB损伤修复,但SIRT7对Mre11激活和MRN复合物形成的影响有待深入研究。研究目的研究SIRT7在HPV-16E7调控DSB损伤修复中的作用及其分子机制。研究方法与结果1.HPV-16E7在低水平DSB损伤下促进修复,在高水平DSB损伤下抑制修复Western Blot 检测结果显示,用包装 HPV-16E7 过表达载体(pBabe-HPV-16E7)的逆转录病毒感染的HaCat细胞,与感染对照组(pBabe-puro)相比,HPV-16E7和p53蛋白表达水平显著上调。流式细胞和中性彗星试验显示,用10μg/ml博来霉素处理细胞0.5h并释放1h后,实验组中γH2AX多聚体明显减少,尾矩(olive tail moment,OTM)明显降低;而20μg/ml博来霉素处理细胞0.5h并释放1h后,实验组中γH2AX多聚体明显增多且OTM升高。检测修复相关蛋白的结果显示,HPV-16E7在低剂量博来霉素诱导下促进修复蛋白pBRCA1(同源重组修复相关蛋白)、XRCC4(非同源末端连接相关蛋白)的表达,而在高剂量下抑制修复蛋白的表达。2.HPV-16E7通过调节SIRT7表达影响DSB损伤修复实时荧光定量 PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,QRT-PCR)和Western Blot结果显示,HPV-16E7在低水平DSB损伤时上调SIRT7的mRNA和蛋白表达水平,而在高水平DSB损伤时下调SIRT7表达。用siRNA-SIRT7转染过表达HPV-16E7的HaCat细胞及对照细胞,加入不同浓度博来霉素处理0.5h并释放1h。流式细胞实验和中性彗星实验发现,与siRNA对照组(siRNA-negative control)相比,siRNA-SIRT7组的yH2AX多聚体增多且OTM升高,说明敲低SIRT7能够部分逆转HPV-16E7对DSB损伤修复的影响。Western Blot实验结果显示,siRNA-SIRT7能够上调pBRCA1而下调XRCC4的表达。3.上调SIRT7的表达促进DSB损伤修复,下调SIRT7的表达抑制DSB损伤修复在HaCat细胞中转染pcDNA3.1-Flag-SIRT7质粒,加入不同浓度博来霉素处理0.5h并释放1h后,收集细胞进行yH2AX流式细胞和中性彗星实验检测,结果显示,过表达SIRT7能够促进细胞DSB损伤修复。Western Blot结果显示,过表达SIRT7上调XRCC4的表达而下调pBRCA1的表达。Western Blot检测证明包装shRNA-SIRT7的慢病毒感染可有效下调HaCat细胞中SIRT7的蛋白水平。γH2AX流式细胞和中性彗星实验结果显示,相较于对照组,shRNA-SIRT7组DSB损伤水平明显升高。修复相关蛋白的检测结果显示,敲低SIRT7可上调pBRCA1的表达而下调XRCC4的表达。4.回复表达SIRT7(wt)促进DSB损伤修复在敲低SIRT7的细胞中通过质粒转染回复表达野生型SIRT7(wt)和不具有去乙酰化活性的突变型SIRT7(H187Y),用不同浓度的博来霉素处理细胞0.5h并释放1h后,通过yH2AX流式细胞术和中性彗星实验检测细胞的DSB损伤水平,结果显示SIRT7(wt)回复表达能够降低DSB损伤水平,而SIRT7(H187Y)不具有这种功能。Western Blot结果表明,SIRT7(wt)促进XRCC4的表达而抑制pBRCA1的表达,SIRT7(H187Y)则不具有这种功能。5.SIRT7去乙酰化Mre11,从而促进Mre11磷酸化和MRN复合物形成免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)实验结果表明,SIRT7能够共沉淀Mre11 且Mre11 能够共沉淀SIRT7。免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)结果显示:shRNA-SIRT7介导的SIRT7下调增加了 Mre11乙酰化水平,并抑制Mre11 676位丝氨酸(Ser676)磷酸化;回复表达SIRT7(wt)能够部分逆转敲低SIRT7对Mre11乙酰化和磷酸化的影响,而SIRT7(H187Y)不具有这种功能。免疫荧光染色和Co-IP结果显示,敲低SIRT7能够抑制MRN复合物三种成分的共定位和共沉淀,回复表达SIRT7(wt)可部分逆转敲低SIRT7对MRN复合物形成的影响,而SIRT7(H187Y)不具有这种功能。研究结论1.低水平DSB损伤时,HPV-16E7促进DNA修复;高水平DSB损伤时,HPV-16E7抑制DNA修复。2.HPV-16E7通过调节SIRT7的表达影响DSB损伤修复。低水平DSB损伤时,HPV-16E7上调SIRT7的表达,而高水平DSB损伤时,HPV-16E7下调SIRT7的表达。3.SIRT7去乙酰化Mre11,从而促进其Ser676磷酸化和MRN复合物的形成,并促进DSB损伤修复。
【图文】：

逡逑胞损伤程度，而释放ｌｈ后的结果反映细胞ＤＳＢ修复水平。如图２Ａ和２Ｂ结果逡逑显示：低剂量博来霉素加药并释放ｌｈ后，ＨａＣａｔ－１６Ｅ７细胞ＤＳＢ损伤相对较轻；逡逑而高剂量博来霉素加药并释放ｌｈ后，ＨａＣａｔ－１６Ｅ７细胞ＤＳＢ损伤程度相对较重。逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ检测修复相关蛋白的表达，结果显示ＨＰＶ－１６Ｅ７在低水平ＤＳＢ损伤逡逑情况下促进修复蛋白（ｐＢＲＣＡｌ、ＸＲＣＣ４）的表达，高水平ＤＳＢ损伤情况下抑逡逑制ｐＢＲＣＡｌ表达且延迟ＸＲＣＣ４表达（图２Ｃ）。逡逑加丨）逦０逦１０逦１０逦０逦２０逦２０逦（０．５ｈ）逡逑ｒｅｌｅａｓｅ邋ｔｉｍａｊｈ｝逦０逦０逦１逦０逦０逦１逡逑１0邋０．２９邋ｌｂ邋８．７２Ｊ邋％逦０．２３Ｊ逦１１．５逦？０逦１０．７一逡逑Ｈａｃａ＂ＰＢａｂ＊逡逑■］０逦１逦９９．７逦－０逦９１．３逦０逦８６．５逦０逦９９．８逦－＊＇０逦８８．５逦０逦８９．３逡逑ｘ逦：．逦■逦■逦■逦ｉ逦邋逦邋，，逦逦逦邋逦逦逦逦逦邋．．逦．．．．逦逡逑？邋Ｍ＊逦Ａｔｍ邋■＃）？＊逦－？？？．逦ｍ－．邋ｍｍ邋Ｍｍ邋ｍｍ＊逦？＊逦？＊＊＊邋＾逦？？逦？＊邋ｖｉｍ逦ｍｃ＊逦ｉｍ邋＊ｍ逦ｙｍ邋ｗ邋ｍ？逡逑Ｘ逦＜Ｓ＊４逦ｆＸｔＡ：逡逑爸逡逑—！ｆ＾逡逑０逦９８．９逦？ｉ0逦９０．７逦０逦９０．１逦＾）０逦９８．７逦：０逦ｊ邋９１．１逦ｖｊ0逦８５．８逡逑Ｌ＿＞，＿＿，＿＿逦，￣￣￣Ｉ逦Ｕ．．．Ｔ＿＿

Ａ．邋７Ｈ２ＡＸ流式细胞术检测经不同浓度博来霉素处理的ＨａＣａｔ－１６Ｅ７和对照细胞逡逑中，ＳＩＲＴ７下调对ＤＳＢ损伤的影响；Ｂ．中性彗星实验检测经不同浓度博来霉素逡逑处理的ＨａＣａｔ－１６Ｅ７和对照细胞中，ＳＩＲＴ７下调对ＤＳＢ损伤的影响；Ｃ．邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ逡逑检测经不同浓度博来霉素处理的ＨａＣａｔ－１６Ｅ７和对照细胞中，ＳＩＲＴ７下调对修复逡逑相关蛋白表达的影响。逡逑４２逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33

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本文编号：2644673