滋养细胞p38-Wip1反馈通路异常诱导子痫前期发生机制研究

发布时间：2020-05-05 16:08

【摘要】：研究背景和目的:滋养细胞功能异常是引起子痫前期的重要因素,目前滋养细胞功能的调控机制尚未完全阐明。滋养细胞因持续缺氧所导致的过度凋亡可影响胎盘形成过程,进而诱发包括子痫前期(Preeclampsia,PE)在内的多种妊娠相关疾病。野生型p53诱导磷酸酶(Wild-type p53-induced phosphatase,Wip1)可通过p38和p53途径正向调控肿瘤细胞生存,但其在滋养细胞中的表达方式及调控作用目前尚无报道。本课题将探讨Wip1通过p53依赖途径调控滋养细胞凋亡具体机制,以期为子痫前期发病机制提供新的研究方向。方法:WB和RT-qPCR分别检测正常与PE胎盘组织中Wip1蛋白和mRNA水平;免疫组化和免疫荧光分别检测胎盘组织和HTR8/SVneo细胞中Wip1的表达定位;运用物理和化学方法构建两种滋养细胞体外缺氧模型,并使用Wip1特异性抑制剂GSK2830371和慢病毒包被短发夹RNA(shRNA)分别抑制Wip1酶活性和表达后,通过流式细胞术检测细胞凋亡水平变化,同时WB检测cleaved-caspase 9等凋亡相关分子以进一步验证。单独或联合运用p38、Mdm2和蛋白酶体特异性抑制剂处理细胞模型以检测反馈通路中各信号分子的相互作用;通过免疫共沉淀检测Wip1对Mdm2-p53互作的调控作用;最后,WB验证胎盘组织中各信号分子的表达情况。结果:Wip1在PE胎盘和PE细胞模型中均显著上调,药物抑制Wip1活性和慢病毒敲降Wip1后均可部分逆转缺氧所诱导的p38磷酸化、cleaved-caspase 9和细胞凋亡水平,同时促进p53在Ser15位点的磷酸化,并抑制Mdm2-p53结合。Mdm2降解受到抑制后可导致p53失稳态,并抑制p38-Wip1反馈途径;Mdm2-p53互作减少可使p53累积并激活p38-Wip1反馈途径。参与调控滋养细胞p38-Wip1反馈通路的调节因素中,Mdm2-p53的互作过程比Mdm2的稳态发挥着更为重要的作用。结论:缺氧应激状态下,滋养细胞通过p38-Wip1反馈途径来维持p53稳态,当该反馈途径发生紊乱时可引起滋养细胞过度凋亡,进而诱发PE发生。
【图文】：

胎盘,绒毛,绒毛外滋养细胞,细胞滋养细胞

24图 1 Wip1 在 PE 胎盘和缺氧细胞模型中表达异常Fig. 1. Expression pattern of Wip1 is altered in PE placentas and trophoblastic PE modelsA. 对正常孕妇的绒毛（a-c）、晚期胎盘（d-f）和蜕膜组织（g-h）进行 CK7、CD31、HLA-G和 Wip1 染色来检测 Wip1 在内皮细胞、细胞滋养细胞、合体滋养细胞、绒毛外滋养细胞和绒毛柱中的表达定位情况。比例尺=200μm；B. 正常胎盘和 PE 胎盘中 Wip1 mRNA 相对表达水平，，n=7，*p＜0.05，采用 student’s-t 检验进行统计分析；C. 正常胎盘和 PE 胎盘组织中 Wip1蛋白相对表达水平，n=7，***p＜0.001，采用 student’s-t 检验进行统计分析；D. 对 24 小时缺氧、常氧处理后的 HTR8/SVneo 细胞进行免疫荧光染色，比较不同处理下 Wip1（绿色荧光）相对表达水平，DAPI（蓝色荧光）用于染细胞核。比例尺=100μm；E-F. 免疫印迹检测 24 小时缺氧处理后 AMPKα、ACC 磷酸化水平及 Wip1 表达水平的变化。n=4，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，采用 student’s-t 检验进行统计分析。所有实验均重复三次。

慢病毒,细胞株,转染

ncluded as control. Nuclei were counterstained by DAPI (blue). Scale bar, 100μ m; Ehosphorylation levels of AMPKα and ACC, and Wip1 protein expression in HTR8/SVneo cfter 24 h of HII (E) and SIB (F) treatments were examined by Western blotting. n=4, *P<0*P<0.01, ***P<0.001, Student’s t-test. Experiments were performed in triplicate..4 抑制 Wip1 可降低 HTR8/SVneo 细胞因缺氧所致的凋亡水平为探究Wip1在滋养细胞中调控作用是否与肿瘤细胞一致——负性调控凋亡，本课题组首先通过慢病毒转染的方法构建 Wip1 敲降细胞株，并结合使用 W异性抑制剂 GSK2830371，然后利用流式细胞仪检测细胞凋亡水平的变化。结示慢病毒转染效率可达 90%以上，敲降效率为 51.16%（图 2A-B）；HII 和 S种缺氧条件均可明显上调 HTR8/SVneo 细胞凋亡水平，而慢病毒转染SK2830371 处理后可明显降低细胞因缺氧引起的凋亡水平（图 3A-C）。这些结明，Wip1 在滋养细胞中调控凋亡的方式与肿瘤细胞并不相同，呈现为正向调现象。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714.244

【相似文献】