18-三体综合征母体胎源性CeRNA网络调控分析

发布时间：2020-05-06 18:57

【摘要】：竞争性内源性RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)是指具有miRNA结合位点,能够竞争性结合miRNA,抑制miRNA对靶基因调控的一类RNA。ceRNA并不是新的RNA分子,而是最新发现的具有调控功能的一类RNA。其中包含mRNA、lncRNA、假基因、circRNA和sRNA等。18-三体综合征(18-trisomy syndrome)又称为爱德华综合征(Edwards syndrome),是常见的染色体三体征,是由于人类18号染色体增多1条造成的染色体畸变,该类患儿临床表现差异大,可从重度先天畸形到近似正常,重度的临床表现为严重的神经系统发育障碍、面部畸形、生长迟缓、骨骼异常、心脏和肾脏畸形等。由于18-三体综合征患儿在胎儿期即存在较高的自然流产率,故新生儿18-三体综合征的患病率为1/8 000-1/6 000,仅次于唐氏综合征(Downsyndrome,DS)的发病率,存在严重的智力低下和多种缺陷,生活往往不能自理,社会适应和劳动能力较差,给家庭和社会造成沉重的经济负担。创立新型的无创产前筛查,寻找18-三体综合征产前诊断的标志物十分重要。本研究主要从circRNA的差异性表达与mi RNA结合位点分析、circRNA与miRNA、mRNA三者的网络分析、lncRNA在已知类型的基因分布情况以及lncRNA差异表达分析和lncRNA与mi RNA、mRNA相互关联分析、sRNA与已知miRNA分析和新miRNA预测等方面进行研究分析。目的:通过获得的全转录组测序表达谱筛选母血(ES-2)和脐带血(ES-1)中差异性表达的lncRNA、circRNA和mi RNA,并对差异性表达的circRNA、lncRNA、sRNA与mRNA、mi RNA进行关联分析,探讨ceRNA在18-三体综合征中的网络调控及其作用机制。方法:选取产前诊断指征为18-三体综合症的2名孕妇的外周血以及脐带血,对照组为正常的相同孕周期的孕妇脐带血和外周血,利用Trizol法提取总RNA,使用NanoDrop ND-1000检测RNA是否降解并测定RNA浓度;采用DEGseq分析18-三体综合症孕妇的外周血以及脐带血中的circRNA、LncRNA和s RNA差异表达谱。根据circRNA、LncRNA和s RNA以及miRNA与mRNA可能存在的相互作用,分析18-三体综合征孕妇的脐带血以及外周血中表达共同显著差异的circRNA、LncRNA和sRNA与mRNA可能存在的关联关系。结果:(1)妊娠18-三体综合征孕妇的脐带血circRNA表达谱分析发现差异表达显著的circRNA 10050个,其中下调表达circRNA 5164个,上调表达circRNA 4886个。(2)妊娠18-三体综合征孕妇的外周血circRNA表达谱分析发现差异表达显著的circRNA13278个,其中下调表达circRNA 5007个,上调表达circRNA 8271个。(3)妊娠18-三体综合征孕妇的脐带血和外周血circRNA表达谱进行共同分析发现2876个共同差异,但只有1510个上调下调方向一致,其中共同下调表达circRNA1064个,共同上调表达circRNA 466个,其中hg38_circ_0012295的差异倍数最大。(4)妊娠18-三体综合征孕妇的脐带血lncRNA表达谱分析发现差异表达显著的lncRNA 1824个,其中下调表达lncRNA 858个,上调表达lncRNA 966个。(5)妊娠18-三体综合征孕妇的外周血lncRNA表达谱分析发现差异表达显著的lncRNA 1063个,其中下调表达lncRNA 628个,上调表达lncRNA 535个。(6)妊娠18-三体综合征孕妇脐带血与外周血中共同表达差异的lncRNA为586个。脐带血中与18号染色体相关的lncRNA-mRNA分析有65个lncRNA对应相关有114个基因,其中RP11-231E4.5与CNDP2基因的lncRNA-mRNA关联最多。我们挑选了共同差异倍数大的lncRNA对应的5个关键基因,分别是CTD-2561J22.5、RP11-203J24.8、JPX、LINC00998、RP11-231E4.5,这5个关键基因不仅在脐带血中显著差异表达,而且在孕妇外周血也有同样的表现。(7)通过对sRNA与miRNA表达谱的关联关系分析,发现hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-15b-3p、hsa-mi R-182-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-4433a-3p、hsa-mi R-4433b-5p、hsa-miR-7706、hsa-miR-941共10个差异表达miRNA,特别是hsa-miR-20a-5p调控其对应靶基因mRNA的表达差异倍数最大。(8)挑选出18-三体综合征脐带血和孕妇的外周血中ceRNA差异表达与mRNA之间的共同的关键节点23个miRNA(hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-500a-3p、hsa-miR-7706、hsa-miR-941、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-382-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-624-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-27a-3p),这些关键节点是ceRNA与miRNA、miRNA与mRNA的相互作用的中心枢纽,以不同的方式调控,相互作用,相互影响。(9)对circRNA差异基因进行GO分析,发现参与生物过程的基因有9131个,参与细胞组成的基因有1201个,参与分子功能的基因有2321个;对差异基因进行Pathway通路分析,挑选富集的前20位通路分析,发现脐带血和外周血的胞吞作用通路最富集。结论:(1)差异表达circRNA、lncRNA、sRNA有其对应的miRNA结合位点,有且还可能不止一个,结合位点同时也可能是其他ceRNA的共同位点,通过与mi RNA的相互作用,共同调控靶基因的表达。ceRNA在未来有可能成为18-三体综合征新的分子生物学标志物。(2)差异表达基因可能通过多种途径、角色参与18-三体综合征的发生。(3)CTD-2561J22.5、RP11-203J24.8、JPX、LINC00998、RP11-231E4.5这5个失调lncRNA有可能对18-三体综合征的发生、发展有重要影响。(4)挑选出关键节点的23个miRNA通过ceRNA与miRNA、miRNA与mRNA的相互作用,以不同的方式调控,相互作用,相互影响,其中,hsa-miR-148b-3p和hsa-miR-941最有可能成为诊断18-三体综合征的生物标志物。
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图 2 sRNA 样品制备流程图Fig.2 sRNA sample preparation flow chart样品检测：每个样品总量为 3μg 总 RNA 用作输入t 产生测序文库多重小 RNA 文库制备套件适用于码被添加到属性序列到每个样品。：简而言之，NEB 3'SR 适配器直接和特异性连 3'末端。3'结扎后反应，SR RT 引物杂交到过量持自由）并转化单链 DNA 接头转化成双链 DNA二聚体形成，此外，dsDNA 不是连接的底物由 T的连接步骤中不连接到 5'SR 衔接子上。：将 5'末端衔接子连接至 miRNA 的 5'末端，sNA 合成：第一链 cDNA 逆转录酶（RNase H）的 使用 PCR 进行 PCR 扩增 LongAmp Taq 2X Mas

查样本符合标准后，接着在 Small RNA Sampll RNA 的 3'及 5'端特殊构造（5'端有完整的 作为原始样本，所以把接头直接加到 Small。紧接着经过 PCR 扩增仪，，PAGE 胶电泳分离就是 cDNA 文库。构建原理图如下图 3：之后，要求初步把文库的浓度稀释到 1ng/ul接着在 Agilent 2100 上实施测定文库的插入片效浓度大于 2nM 为止，这个步骤可以达到文称 Q-PCR。的标准后，将库检合格的插入片段按对应的有要求的 pooling 后，最后在 HiSeq/MiSeq 进行
【学位授予单位】：广西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.5

【参考文献】

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1 李培飞;陈声灿;邵永富;蒋孝明;肖丙秀;郭俊明;;环状RNA的生物学功能及其在疾病发生中的作用[J];生物物理学报;2014年01期

本文编号：2651716