雌激素受体α阳性巨噬细胞对子宫内膜癌细胞侵袭迁移的影响及机制研究

发布时间：2020-05-07 20:32

【摘要】：研究背景研究表明,慢性炎症反应通过调控肿瘤微环境组织结构重塑,促进子宫内膜癌的生长、转移和血管生成等。由于子宫内膜存在周期性的损伤和修复,因此,在子宫内膜癌中存在比较明显且持久的炎症反应过程。肿瘤微环境中免疫细胞约半数为巨噬细胞。巨噬细胞来源于血液中的单核细胞并且具有两种不同表型:M1型(由IFN-γ和LPS所诱导)和M2型(由IL-4和IL-13所诱导)。M1型巨噬细胞主要功能是呈递抗原和杀伤病原微生物,而M2型主要发挥促肿瘤效应。肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophage,TAM)通过释放炎性介质促进恶性肿瘤的进展,被认为呈现M2表型。目前,关于TAM如何在子宫内膜癌中发挥作用仍不清晰。研究发现,雌激素对肿瘤微环境具有潜在的免疫调控作用。目前为止,已有研究报道某些肿瘤的巨噬细胞上表达雌激素受体(Estrogen receptor,ER),雌激素可调控巨噬细胞的极化和浸润,参与肿瘤的发生与发展。在卵巢癌巨噬细胞上检测到ERα和ERβ的表达,雌激素通过调节巨噬细胞的活化与募集,进而促进肿瘤的生长。小鼠肺癌模型中,检测到巨噬细胞表达ERβ,雌激素可增强巨噬细胞分泌VEGF,促进巨噬细胞向肿瘤部位募集,参与调控肿瘤的进展。此外,子宫内膜异位症在位内膜的巨噬细胞呈ER 阳性,雌激素可刺激巨噬细胞分泌VEGF和HGF,促进病灶生长。综上所述,在某些肿瘤中,雌激素可与微环境巨噬细胞相互作用,共同调控肿瘤的恶性进展。但巨噬细胞上ER的功能及其作用的分子机制尚未得到很好的阐述。目前为止,关于子宫内膜癌微环境巨噬细胞上ER的表达情况及其在肿瘤进展中的作用机制,仍未有研究报道。Yeh CR等人的研究揭示了 ERα与C-C趋化因子配体(C-C Motif Chemokine Ligand,CCL)的相关性。CCL18是一种主要由M2型巨噬细胞分泌的趋化因子。在卵巢癌、胶质瘤、胃癌等微环境巨噬细胞中发现了 CCL18的上调。此外,CCL18可诱导乳腺癌细胞发生上皮间叶转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)。EMT是指上皮细胞呈现间充质样特性,获得更强的侵袭性,是癌细胞转移的主要途径。癌细胞转移过程往往伴随细胞形态和骨架状态的改变。驱动蛋白超家族(Kinesin superfamily proteins,KIFs)是以微管作为其运动轨道的马达分子,主要参与细胞运动相关的功能。大量研究表明,KIFs在肿瘤发生与发展过程中扮演重要的角色。大量研究已经证实,雌激素除了直接作用于肿瘤细胞ER,还可通过微环境巨噬细胞ER间接调控肿瘤的发生与发展。我们首次发现子宫内膜癌微环境中巨噬细胞表达ERα,推测雌激素可介导肿瘤细胞与微环境巨噬细胞之间的相互作用共同参与子宫内膜癌的发展。本研究中,我们将通过免疫组化方法初步探索ERα阳性巨噬细胞在子宫内膜癌进展中的作用。通过体外实验分析巨噬细胞可否通过ERα调控子宫内膜癌细胞的迁移行为,并探究其潜在分子机制。本研究描述了雌激素对子宫内膜癌微环境影响的新见解,揭示了雌激素参与子宫内膜癌进展的另一种途径。第一部分ERα在子宫内膜癌巨噬细胞的表达及其临床意义目的检测子宫内膜癌微环境巨噬细胞上ERα的表达情况,并且探索ERα阳性巨噬细胞在子宫内膜癌进展中的临床意义。方法1.购买含有85例子宫内膜癌组织及85例癌旁正常子宫内膜组织的芯片,进行CD68和ERα染色。肿瘤中CD68阳性巨噬细胞根据其分布位置被分为3组:癌巢、间质以及交界区。通过卡方检验分析不同部位的巨噬细胞密度与患者临床病理参数的相关性。此外,还分析了上皮和间质ERα水平与患者临床FIGO分期之间的相关性。2.为了进一步验证子宫内膜癌巨噬细胞表达ERα,根据免疫组化双染试剂盒说明书进行了 CD68/ERα双染,同时探究了ERα阳性巨噬细胞数量与患者临床FIGO分期之间的相关性。结果1.巨噬细胞存在于65.8%(56/85)的子宫内膜癌组织中。子宫内膜癌组织中巨噬细胞的平均数量明显高于正常子宫内膜组织(P0.001)。间质或者交界区巨噬细胞数目明显高于癌巢(P0.001,P0.001),而间质和交界区巨噬细胞数目无显著差异(P0.05)。此外,间质巨噬细胞数目与患者FIGO分期以及是否具有淋巴结转移呈显著正相关。2.上皮及间质ERα的表达水平在晚期(FIGO Ⅲ-Ⅳ期)子宫内膜癌患者明显低于早期(FIGO Ⅰ-Ⅱ期)患者。3.免疫组化双染显示子宫内膜癌巨噬细胞上表达ERα。有巨噬细胞浸润的子宫内膜癌组织中,ERα阳性巨噬细胞占46.4%;而有巨噬细胞浸润的正常子宫内膜组织中,ERα阳性巨噬细胞仅占21.4%(P0.05)。此外,晚期子宫内膜癌组织中ERα阳性巨噬细胞的比例(73.9%)明显高于其在早期子宫内膜癌组织中的比例(27.3%)(P0.0 1)。结论1.子宫内膜癌间质巨噬细胞密度与临床FIGO分期以及是否具有淋巴结转移呈正相关。2.子宫内膜癌上皮及间质ERα水平与临床FIGO分期呈负相关。3.本研究首次报道子宫内膜癌微环境巨噬细胞上表达ERα,提示ERα阳性巨噬细胞可能参与子宫内膜癌的进展。第二部分M2巨噬细胞ERα通过CCL18诱导子宫内膜癌细胞发生上皮间质转化目的通过一系列体外实验研究子宫内膜癌巨噬细胞ERα在肿瘤细胞侵袭转移过程中的作用。方法1.人单核细胞系THP1以及人外周血单核细胞均被诱导为M2型,通过qRT-PCR检测M2型标记物的表达水平,以此鉴定M2型巨噬细胞诱导是否成功。2.M2巨噬细胞经过ERα激动剂(PPT)或者阻断剂(MPP)处理后,然后分别收集各组的条件培养基(CM),用来培养子宫内膜癌细胞Ishikawa和KLE。通过Transwell、细胞划痕以及3D侵袭实验来观察ERα激动剂处理的M2巨噬细胞对子宫内膜癌细胞侵袭和迁移行为的促进作用;通过细胞骨架染色实验来分析ERα激动剂处理的M2巨噬细胞对子宫内膜癌细胞形态、肌动蛋白纤维以及微管状态的影响;分别采用Western blot和qRT-PCR技术来分析ERα激动剂处理的M2巨噬细胞对子宫内膜癌细胞的EMT标记物蛋白以及转录水平的影响。3.采用ELISA以及qRT-PCR技术来分析ERα激动剂对于M2巨噬细胞的细胞因子以及趋化因子谱的影响。此外,采用Western blot技术来探索M2巨噬细胞中ERα介导的CCL18分泌升高的机制。4.通过上述一系列实验来探究重组蛋白CCL18是否可诱导子宫内膜癌细胞发生EMT。此外,采用CCL18中和抗体来验证ERα激动剂处理的M2巨噬细胞通过CCL18来诱导子宫内膜癌细胞发生EMT。结果1.THIP1以及人外周血单核细胞诱导的M2巨噬细胞中M2型标记物的水平明显高于M1巨噬细胞。2.用ERα激动剂处理的M2巨噬细胞的上清(M2-PPT-CM)培养Ishikawa后,Transwell与划痕实验均显示细胞迁移能力显著增强;3D侵袭实验表明M2-PPT-CM处理组细胞在基质胶中侵袭性突触的长度显著长于对照组;细胞骨架染色实验表明M2-PPT-CM处理组的Ishikawa呈明显的间充质样形态,肌动蛋白纤维和微管排列更有规律性和方向性,提示细胞运动活力增强;此外,M2-PPT-CM处理组上皮标记物(E-cadherin)表达显著降低,而间质标记物(N-cadherin,Vimentin)以及转录因子(Twist1)的水平均明显升高。然而,该作用可被雌激素受体α阻断剂(MPP)所抑制。3.与对照组DMSO相比,PPT刺激M2后,CCL18的mRNA水平升高约12倍,蛋白水平升高约2倍,而MPP会抵消PPT引起的CCL18分泌增加。此外,PPT使M2巨噬细胞中ERK1/2蛋白磷酸化升高,在PPT处理2h后达到峰值。然而,ERK1/2抑制剂会抑制PPT引起的M2巨噬细胞中CCL18分泌升高。4.重组蛋白CCL18作用12 h使Ishikawa的迁移和浸润性能呈剂量依赖性升高。重组蛋白CCL18使子宫内膜癌细胞呈明显的间充质样变化。此外,上皮标记物(E-cadherin)的水平显著下调,而间质标记物(N-cadherin,Vimentin)以及转录因子(Twist1)的水平均显著上调。而且,M2-PPT-CM对子宫内膜癌细胞的上述效应可被CCL18中和抗体所抑制。在另一种子宫内膜癌细胞系KLE中得到一致的趋势,ERα激动剂处理的M2巨噬细胞的上清也可以促进KLE的侵袭迁移。此外,ERα激动剂处理的人外周血单核细胞衍生M2巨噬细胞也可以促进子宫内膜癌细胞的侵袭和迁移。结论1.ERα激动剂通过磷酸化ERK1/2促进M2巨噬细胞中CCL18的分泌。2.ERα激动剂处理的THP1来源M2巨噬细胞通过CCL18的分泌诱导子宫内膜癌细胞发生EMT。3.ERα激动剂处理的人外周血单核细胞衍生M2巨噬细胞也可以促进子宫内膜癌细胞发生EMT。第三部分M2巨噬细胞ERα通过CCL18/mTOR/KIF5B介导的上皮间质转化促进子宫内膜癌细胞的侵袭迁移目的探索巨噬细胞ERα诱导子宫内膜癌细胞发生上皮间质转化的潜在机制。方法1.重组蛋白CCL18或M2-PPT-CM作用于子宫内膜癌细胞后,通过qRT-PCR测定KIFs家族分子的转录水平变化;通过转染小干扰RNA沉默子宫内膜癌细胞中KIF5B基因,应用Western blot和qRT-PCR技术检测EMT标记物的水平;重组蛋白CCL18或M2-PPT-CM作用于敲除KIF5B的子宫内膜癌细胞,通过Transwell实验观察细胞迁移性的改变;通过细胞骨架免疫荧光染色实验,观察细胞形态以及骨架状态的改变。2.对含有85例子宫内膜癌组织及85例癌旁正常子宫内膜组织的芯片进行KIF5B染色,分析KIF5B的水平与患者临床病理参数的相关性,并且进一步分析了肿瘤组织KIF5B的水平与间质巨噬细胞密度的关联性。3.重组蛋白CCL18或M2-PPT-CM作用于子宫内膜癌细胞后,通过Western blot技术检测PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白的磷酸化水平;重组蛋白CCL18或M2-PPT-CM作用于加或不加mTOR抑制剂的子宫内膜癌细胞后,通过qRT-PCR技术测定KIFs家族分子的转录水平改变以及Transwell实验观察子宫内膜癌细胞迁移性的改变。结果1.重组蛋白CCL18或M2-PPT-CM可显著上调Ishikawa中KIF5B的转录水平;敲除子宫内膜癌细胞中KIF5B后,上皮标记物(E-cadherin)的转录水平显著升高,而间质标记物(N-cadherin,Vimentin)以及转录因子(Twistl)的转录水平均显著下调;重组蛋白CCL18或M2-PPT-CM不会影响敲除KIF5B的子宫内膜癌细胞的迁移能力以及细胞形态和细胞骨架状态。2.子宫内膜癌组织中KIF5B的水平显著高于正常子宫内膜组织(P0.001)。而且,肿瘤组织的KIF5B染色强度与子宫内膜癌临床FIGO分期以及是否存在淋巴结转移呈显著正相关。此外,肿瘤组织KIF5B的表达水平与巨噬细胞数量呈正相关。3.重组蛋白CCL18或M2-PPT-CM作用于子宫内膜癌细胞2h后,AKT和mTOR的蛋白磷酸化水平显著升高;重组蛋白CCL18或M2-PPT-CM上调子宫内膜癌细胞中KIF5B的表达以及促进迁移的作用均会被mTOR抑制剂所逆转。结论1.本研究首次揭示了KIF5B与EMT的相关性。2.子宫内膜癌中KIF5B表达与肿瘤进展密切相关,并且巨噬细胞浸润与KIF5B的表达水平呈正相关。3.ERα激动剂处理的M2巨噬细胞通过PI3K/AKT/mTOR通路上调KIF5B表达从而诱导子宫内膜癌细胞发生EMT。
【图文】：

子宫内膜腺癌,巨噬细胞,平均数量,肿瘤组织

图１－１子宫内膜腺癌组织中ＣＤ６８和ＥＲａ的表达逡逑（ａ）肿瘤组织和对照组正常组织中ＣＤ６８＋巨噬细胞的平均数量。每个符号代表一例逡逑组织（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ邋ｆ／－检验）。（ｂ）８５例子宫内膜腺癌样本中ＣＤ６８阳性细胞的典逡逑型图片示例（放大倍数：ｉ，邋２００倍；ｉｉ，邋２００倍；ｉｉｉ，邋２００倍）。（ｉ）癌巢ＣＤ６８＋巨噬细胞；逡逑（ｉｉ）间质ＣＤ６８＋巨噬细胞；（ｉｉｉ）交界区ＣＤ６８＋巨噬细胞。（ｃ）８５例子宫内膜癌样本中逡逑癌巢、间质以及交界区巨噬细胞的平均数量。每个符号代表一例组织（单因素方差逡逑分析）。（ｄ）５５例早期及３０例中晚期子宫内膜癌的上皮及间质成分ＥＲａ的表达评逡逑分比较。每个符号代表一例样本（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ邋Ｃ／－检验）。（ｅ）表达ＣＤ６８的子宫内逡逑２９逡逑

激动剂,巨噬细胞,中和抗体,宫内膜癌

Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｍＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ（ｆｏｌｄ邋ｃｈａｎｇｅ）逦Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ邋Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ邋Ｖｉｍｅｎｔｉｎ邋Ｔｗｉｓｔｌ逡逑图２－５邋ＥＲａ激动剂处理的Ｍ２巨噬细胞上清诱导Ｉｓｈｉｋａｗａ发生ＥＭＴ的作用可被逡逑ＣＣＬ１８中和抗体阻断逡逑Ｍ２－ＤＭＳ０－ＣＭ，伴或者不伴邋１０ｐｇ／ｍＬＣＣＬ１８邋中和抗体的邋Ｍ２－ＰＰＴ－ＣＭ，邋Ｍ２－ＰＰＴ逡逑＋ＭＰＰ－ＣＭ四组上清作用于Ｉｓｈｉｋａｗａ。（ａ）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验测定上述四组上清刺激１２逡逑５８逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33

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