AZD1775上调卵巢癌细胞PD-L1的机制探究及其联合αPD-L1治疗卵巢癌的潜在价值

发布时间：2020-05-11 20:13

【摘要】：【目的】AZD1775促进有丝分裂并通过强制细胞连续的进入复制周期来增加基因组的不稳定性,最终导致有丝分裂灾难引起细胞凋亡。然而,目前尚未有AZD1775对免疫微环境的影响的研究。本研究主要目的为阐释AZD1775上调卵巢癌细胞PD-L1的机制及其联合αPD-L1治疗卵巢癌的潜在价值。【方法】CCK8检测了AZD1775对一系列卵巢癌细胞的毒性作用。流式检测了AZD1775对细胞周期的影响。免疫荧光,彗星实验和克隆形成实验用于检测AZD1775对肿瘤细胞的DNA损伤作用。通过实时定量荧光PCR技术(q PCR)及蛋白印迹实验(Western Blot,WB)检测AZD1775处理后ID8细胞,OV2008细胞和C13细胞PD-L1表达变化。AZD1775处理后ID8细胞的RNAseq数据用于机制探究。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测AZD1775处理后ID8细胞,OV2008细胞和C13细胞干扰素表达变化,q PCR及WB检测DNMT1及干扰素信号通路活化相关基因改变,免疫荧光检测ds RNA表达改变来验证AZD1775上调PD-L1表达的机制。ID8移植瘤模型用以评估AZD1775联合αPD-L1治疗卵巢癌的效果。流式细胞术检测小鼠肿瘤组织内免疫细胞成分变化。The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库用于验证基于病毒防御反应相关基因构建的signature对免疫检查点治疗反应预测的准确性【结果】我们证实了AZD1775在卵巢癌细胞中的周期调控和DNA损伤作用。同时,我们发现AZD1775能够明显上调卵巢癌细胞PD-L1的表达。RNAseq数据的GSEA分析发现,AZD1775处理后干扰素信号通路明显富集。AZD1775处理后各型干扰素均有一定程度的分泌,其中变化最显著的是三型干扰素。AZD1775通过ds RNA导致干扰素分泌升高。同时,我们也发现AZD1775能够下调DNMT1的表达介导了内源性逆转录病毒(ERVs)基因的表观调控,进而影响了其转录产物ds RNA的表达。AZD1775下调E2F通路使DNMT1表达下降。动物体内实验发现AZD1775与αPD-L1联合治疗的效果好于单独使用AZD1775。此外,流式检测肿瘤组织内免疫细胞成分,发现AZD1775处理后肿瘤组织内T淋巴细胞比例增加,主要为CD8+T细胞,Treg细胞比例下降,CD8+/Treg比例明显增加。我们利用TCGA数据库RNAseq数据对WEE1基因同CD3e,CD4,CD8a,CD68,DNMT1,STAT1作相关性分析。我们发现WEE1表达同CD3e,CD8a,CD68表达呈负相关,与DNMT1的表达呈正相关。我们基于病毒防御反应基因构建的Signature与TCGA数据库中的卵巢癌数据进行对比,发现该Signature与卵巢癌“免疫反应型”的结果非常吻合。【结论】我们的研究阐释了AZD1775上调卵巢癌细胞PD-L1表达的机制,描述了其联合应用αPD-L1的治疗效果。不但补充了AZD1775在肿瘤免疫微环境中的作用,更重要的是有助于探索更精准的小分子靶向治疗联合免疫治疗的治疗模式,为改善卵巢癌预后开辟一个新的方向。
【图文】：

25 1.AZD1775 在 9 株卵巢癌细胞系中的 IC50。9 株卵巢癌细胞系（C13，OV2008，ID8，Cao90，，OVCAR3，SKOV3，TOV-21G，ES2），给予不同浓度梯度的 AZD1775 处理 48 小时，CC测存活细胞比例，计算每种细胞系的 IC50。为了检测 AZD1775 对卵巢癌细胞的杀伤效果，我们选取了 9 株卵巢癌细胞C13，OV2008，ID8，Caov3，OV90，OVCAR3，SKOV3，TOV-21G，ES2），给同浓度梯度的 AZD1775 处理 48 小时，CCK8 检测存活细胞比例（图 1）。我们发

C13（IC50 =3 23.8nM），OV2008（IC50 = 458.7nM），OVCAR3（IC50 = 590.6nM），SKOV3（IC50 = 770.4nM），TOV-21G（IC50 = 346.1nM），ES-2（IC50 = 285.3nM）对 AZD1775 相对敏感，而 ID8（IC50 = 14.295μM），Caov3（IC50 = 1.911μM），OV90（IC50 = 2.463μM）相对耐药。我们选取了两株人源性卵巢癌细胞系 C13，OV2008和一株鼠源性卵巢癌细胞系 ID8 作为后续研究细胞株。DNA 损伤时，WEE1 可在 G2/M 期检测点阻断细胞有丝分裂，进行 DNA 损伤修复。AZD1775 通过与 WEE1 结合而抑制性的磷酸化 CDK1（CDC2），进而肿瘤细胞损伤 DNA 累积，导致染色体丢失，细胞凋亡，称为“有丝分裂灾难”。C13，OV2008和 ID8 三株卵巢癌细胞系用 AZD1775（800nM）处理 24 小时后，流式检测细胞系周期变化。我们发现，相对于对照组，AZD1775 处理组破坏了 G2/M 期的检查点阻滞，导致细胞过早进入 M 期，G2/M 期比例升高。AZD1775 处理 24 小时后，C13 G2/M 期细胞比例由 17.8%升高到 25.8%，OV2008 G2/M 期细胞比例由 18.8%升高到 26.8%，ID8 G2/M 期细胞比例则由 9.75%升高到 17.7%（图 2）。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31

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本文编号：2658998