miR-320a靶向调控RASSF8对上皮性卵巢癌增殖和转移能力的影响及其机制研究

发布时间：2020-05-12 03:34

【摘要】：卵巢恶性肿瘤是女性生殖道肿瘤中致死率最高的恶性肿瘤,包括多种病理学类型,其中最常见的是上皮性卵巢癌,因卵巢位于盆腔的深处,早期诊断较为困难,且缺乏有效的筛查手段,故卵巢癌患者就诊时,多数已处于晚期。此外卵巢癌容易出现盆腹腔广泛转移、淋巴结转移,所以在女性生殖系统肿瘤中,上皮性卵巢癌的病死率是最高的。肿瘤发生、发展受到多方面因素的影响,包含细胞运动、抑癌或促癌基因表达失调、迁移调控异常等等。目前卵巢癌的标准治疗策略是手术并辅以铂类为基础的化疗,虽然多数患者最初对这种治疗方案有反应,但最终会死于复发和耐药,因此,迫切需要进一步探索卵巢癌发病和发展的分子机制,开发新的治疗方法,以期提高患者的生存率。众所周知,恶性肿瘤的发生、发展受到多方面因素的影响,包含癌基因激活、抑癌基因的失活,从而导致机体内相关信号通路出现异常,促进细胞增殖,形成新生血管、发生远处转移等。目前对于肿瘤细胞如何发生转移,具体机制并不确定,有相关结论提出,肿瘤细胞在运动过程中,在肿瘤微环境的支持下,融入到血液循环系统中,因此被认为是大部分肿瘤发生转移的启动元素,而当肿瘤微环境在促进肿瘤细胞运动过程中,其主要机制即为上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT),它是上皮细胞在特定情况下转变为间充质细胞的形态学过程,在癌症侵袭-转移过程中扮演着重要的作用,该过程涉及众多基因可逆、快速的改变。越来越多的研究发现,肿瘤细胞与上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)之间存在密切关联,细胞在肿瘤微环境中各种成分的相互作用下,可以激活EMT相关转录因子信号通路使上皮细胞向间充质细胞转换,从而使得肿瘤细胞发生浸润和转移。EMT相关转录因子如Slug,Snail和Zebl等可以诱导肿瘤细胞发生EMT,使得肿瘤的侵袭和转移能力增强。另外EMT转换能够赋予肿瘤细胞干细胞样的特征,提高肿瘤细胞的抗凋亡能力,促进恶性肿瘤的发展。然而目前靶向EMT相关转录因子的研究并不成熟,EMT的发生机制涉及多个方面,不仅有转录因子的参与,近年来microRNAs(miRNAs)在EMT及肿瘤进展中的角色逐步显现并成为大家关注的热点。更多的研究指出,在肿瘤的发生、发展和转移过程中,microRNAs(miRNAs)扮演了非常重要的角色,并可能为改善肿瘤患者的治疗结局提供有效的治疗策略。miRNA是一类小的非编码RNA(长度为19-24 nt),通过与3'-非翻译区(3'-UTRs)结合调控靶基因的表达,导致mRNA的降解或翻译抑制。miRNA及其调控的靶基因构成一个调控网络,动态调控各种生物学行为。迄今为止,已发现miR-320a在许多类型的癌症中表达上调或下调,例如肝细胞癌,结肠癌,胃癌和前列腺癌。然而,到目前为止,关于miR-320a和上皮性卵巢癌的相关性的研究鲜有报道。最新有研究分析了从GEO下载的卵巢癌样本,共获得了 17个显著差异表达的miRNA,共表达的网络显示has-miR-320的高表达在卵巢癌样本中显示预后不良,但是miR-320a在EOC中的具体作用机制目前尚无报道。本研究的目的就是探讨miR-320a在上皮性卵巢癌中的表达及其生物学作用。生物信息学软件预测发现,miR-320a在RASSF8 mRNA的3'-UTR区具有潜在结合位点,提示miR-320a可能对RASSF8的表达有靶向调控作用。RASSF8,是一种肿瘤抑制基因,对维持上皮细胞的AJs(附着力粘连点)功能至关重要,并在上皮细胞迁移中发挥作用。RASSF8已被证明在小鼠胚胎和成人的正常组织中普遍表达,并被描述为肺癌、皮肤黑色素瘤和食管鳞状细胞癌发生的潜在肿瘤抑制因子。RASSF8可通过Wnt和NF-κB信号通路对恶性肿瘤的发生、发展起到抑制作用,不仅可以抑制恶性肿瘤细胞增殖,还可以促进细胞凋亡,故其在多种肿瘤中起到抑癌基因的作用,但RASSF8在上皮性卵巢癌中的作用至今未有报道。RASSF8在上皮性卵巢癌中能否发挥作用、它在上皮性卵巢癌中的表达及与miR-320a的关系如何,它可能的调控机制是什么?这些问题目前未有报道,值得我们进一步探讨。本课题旨在研究miR-320a在上皮性卵巢癌中的表达及其生物学作用,并进一步明确miR-320a是否可以通过靶向调控RASSF8促进卵巢癌细胞增殖和转移,探讨miR-320a、RASSF8在卵巢癌细胞增殖及转移中的可能的作用机制,以期为上皮性卵巢癌的治疗提供新的理论依据。第一部分:miR-320a在上皮性卵巢癌组织、细胞系中的表达及细胞功能学研究研究目的1.研究miR-320a在上皮性卵巢癌组织(EOC)中的表达及与临床病理特征的关系;2.探讨miR-320a在上皮性卵巢癌细胞系中的表达及生物学功能,同时对上皮性卵巢癌中miR-320a可能的作用机制进行分析。研究方法1.应用实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测miR-320a在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤和上皮性卵巢癌组织中的表达情况,并分析miR-320a表达与临床病理特征的关系。2.检测miR-320a在卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3、A2780和正常卵巢细胞系IOSE80中的表达。3.在miR-320a表达水平较低的SKOV3细胞中利用慢病毒构建稳定过表达miR-320a的细胞株,在miR-320a表达水平较高的OVCAR3细胞中瞬时转染miR-320a-inhibitor,应用CCK-8实验、Transwell小室模型、细胞流式技术评价miR-320a对卵巢癌细胞的增殖,侵袭、迁移和凋亡能力的改变。行裸鼠成瘤试验对miR-320a过表达后卵巢癌细胞裸鼠成瘤能力进行评价,从体内试验进一步验证miR-320a在卵巢癌中的作用。4.蛋白免疫印迹技术(Western blot)检测过表达和下调miR-320a后卵巢癌细胞株中EMT相关指标的改变。HE染色观察裸鼠生成瘤组织中肿瘤细胞形态及浸润情况,免疫组织化学法对裸鼠生成瘤组织中E-cadherin和Vimentin表达进行评价。研究结果1.miR-320a在EOC组织中表达水平高于正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤;卵巢癌晚期(Ⅲ期、Ⅳ期)组织中miR-320a的表达水平高于它在卵巢癌早期(Ⅰ期、Ⅱ期)样本中的表达水平(P0.05),有淋巴结转移组中miR-320a的表达水平高于无淋巴结转移组(P0.05),但在年龄、组织学分类、病理学分级方面,miR-320a的表达水平无差异(P0.05)。2.miR-320a在三种卵巢癌细胞系(SKOV3、OVCAR3、A2780)中的表达均高于正常卵巢细胞IOSE80的表达。3.miR-320a能促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移,对卵巢癌细胞凋亡无明显影响。裸鼠成瘤试验也证实miR-320a可以促进卵巢癌细胞的增殖。4.miR-320a可以促进卵巢癌细胞EMT行为。与对照组细胞相比,过表达miR-320a可以使SKOV3细胞中E-cadherin表达水平下降,而Vimentin的表达水平上升;下调miR-320a可以使OVCAR3细胞中E-cadherin表达水平上升,而Vimentin的表达水平下降。采用免疫组织化学方法对裸鼠成瘤组织中E-cadherin和Vimentin表达水平进行检测,结果示:相较于SKOV3/miR-NC成瘤组,SKOV3/miR-320a成瘤组中的Vimentin表达水平相对更高,但E-cadherin表达水平却低于前者。这些发现同样支持了miR-320a可能促进EOC细胞EMT的假设。结论1.在上皮性卵巢癌组织及细胞系中miR-320a高表达,提示miR-320a可能是卵巢癌的潜在促癌基因,在上皮性卵巢癌的发生、发展过程中起重要作用。2.miR-320a能促进卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移,对卵巢癌细胞凋亡无明显影响;3.miR-320a可以促进卵巢癌细胞EMT行为。第二部分:miR-320a靶基因RASSF8的预测、鉴定研究目的通过第一部分研究发现,在上皮性卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中miR-320a高表达,提示miR-320a可能作为促癌基因参与卵巢癌的发生发展。那么miR-320a在卵巢癌中是通过哪个靶基因来发挥它的生物学功能的?本部分试验通过生物信息学方法预测miR-320a的靶基因,在卵巢癌细胞中进一步验证miR-320a如何靶向作用于靶基因,该问题的阐述可为深入理解卵巢癌的发病机制和探寻新的治疗方法提供新的方向。研究方法1.采用生物信息学方法,利用三种生物信息学软件(TargetScan miRTarBase,miRBase)对靶基因进行初步预测。2.采用qRT-PCR方法检测RASSF8在卵巢癌细胞系(SKOV3,OVCAR3,A2780)与正常卵巢细胞系(IOSE80)中的mRNA水平,初步探讨RASSF8在EOC中的作用。3.利用双荧光素酶报告基因载体构建野生型pGL3-RASSF8-WT和突变型pGL3-RASSF8-Mut,与miR-320a共同转染细胞,来观察miR-320a过表达对突变型和野生型pGL3-RASSF8的荧光素酶活性的影响,进一步明确miR-320a是否可直接靶向作用于RASSF8的3'-UTR区。4.通过qRT-PCR及Western Blot方法分别对miR-320a过表达后的SKOV3细胞及miR-320a下调后的OVCAR3细胞中的RASSF8 mRNA和蛋白表达水平进行检测,以进一步明确卵巢癌细胞中miR-320a与RASSF8的表达之间的关系。研究结果1.利用生物信息学方法,分析并预测RASSF8是miR-320a的靶基因。2.RASSF8在卵巢癌细胞系(SKOV3,OVCAR3,A2780)中的表达水平低于正常卵巢细胞系(IOSE80)。3.miR-320a可以靶向作用于RASSF8的3'-UTR区。4.miR-320a过表达或下调可以负性调控卵巢癌细胞中RASSF8的mRNA和蛋白水平。结论1.经实验证实,RASSF8是miR-320a的靶基因。2.miR-320a可以负性调控RASSF8在卵巢癌中的表达水平。第三部分RASSF8对上皮性卵巢癌生物学的影响及调控机制的初步探讨研究目的1.研究RASSF8在上皮性卵巢癌组织中的表达;2.探讨RASSF8在上皮性卵巢癌细胞中的生物学作用,并探索其在上皮性卵巢癌中可能的调控机制。研究方法1.应用免疫组化方法检测RASSF8在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤和上皮性卵巢癌组织中的表达情况。采用qRT-PCR方法对20例卵巢癌组织和20例癌旁正常组织中RASSF8 mRNA的表达进行研究。2.将靶向RASSF8的siRNA和Negative Control转染入SKOV3细胞,应用CCK-8实验、Transwell小室模型评价RASSF8下调后卵巢癌细胞的增殖,侵袭、迁移能力的变化。3.蛋白免疫印迹技术(Western blot)检测RASSF8下调后NF-κB信号通路P65,p-P65,IκBα表达的改变。研究结果1.免疫组化结果显示RASSF8在卵巢癌组织中的表达量明显低于正常卵巢上皮及卵巢良性肿瘤,差异具有统计学意义(P0.05)。qRT-PCR方法对20例卵巢癌组织和20例癌旁正常组织中RASSF8 mRNA的表达进行研究,结果显示:与癌旁正常组织相比,RASSF8 mRNA在卵巢癌中的表达量明显下降(P0.01),提示RASSF8在EOC中可能起到抑癌作用。2.RASSF8可以抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移。与阴性对照组相比,下调RASSF8可以促进SKOV3细胞的增殖能力,侵袭和迁移细胞数目均高于对照组。3.RASSF8可能通过调控NF-κB信号通路发挥抑癌作用。结果显示:与对照组相比,下调RASSF8后,P65和p-P65的表达增加,而IκBα表达会下降,差异有统计学意义。结论RASSF8在上皮性卵巢癌中起到抑癌作用,并可能通过调控NF-κB信号通路发挥作用。
【图文】：

细胞系,卵巢癌组织,卵巢组织,统计学意义

１．２采用ｑＲＴ－ｑＰＣＲ对２０对ＥＯＣ组织和邻近正常卵巢组织中ｍｉＲ－３２０ａ的表逡逑达进行检测。结果显示，ｍｉＲ－３２０ａ在卵巢癌组织中的表达水平要高于癌旁正常逡逑卵巢组织，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１；图１）。逡逑＾逦２．５ｉ逡逑0逦＊＊逡逑２逦２．０－逦—｜—逡逑§逦１－５－逡逑（／）逡逑０逡逑９－邋１．０－逦逡逑①逡逑？＾３逦０．５￣逡逑ＣＵ逡逑０）逡逑＾邋0．0Ｊ逦逦１逦逦逦１逦—逡逑Ｎｏｒｍａｌ（Ｎ＝２０）逦Ｃａｎｃｅｒ（Ｎ＝２０）逡逑图１邋．ｍｉＲ－３２０ａ在２０对ＥＯＣ组织和邻近正常卵巢组织中的表达（Ａｌ＞＜０．０１）逡逑１．３此外，与正常卵巢细胞系相比，三种Ｂ３Ｃ细胞系中ｍｉＲ－３２０ａ的表达水逡逑平较高（图２），上述所有结果提示ｍｉＲ－３２０ａ在ＥＯＣ组织及细胞系中表达上调，逡逑４１逡逑

细胞系

图１邋．ｍｉＲ－３２０ａ在２０对ＥＯＣ组织和邻近正常卵巢组织中的表达（Ａｌ＞＜０．０１）逡逑１．３此外，与正常卵巢细胞系相比，三种Ｂ３Ｃ细胞系中ｍｉＲ－３２０ａ的表达水逡逑平较高（图２），，上述所有结果提示ｍｉＲ－３２０ａ在ＥＯＣ组织及细胞系中表达上调，逡逑４１逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.31

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