乙酰基转移酶MOF参与抑制子宫内膜癌进程及稳定雌激素受体α的作用解析

发布时间：2020-05-17 15:19

【摘要】：目的:乙酰基转移酶MOF是MYST家族中的一员,通过介导组蛋白H4K16的乙酰化参与活性化的转录调节。文献报道表明,MOF参与多种重要的细胞功能,如细胞应激反应,细胞周期进程,DNA损伤修复与自噬等功能。研究发现MOF在不同的肿瘤中发挥不同的功能,如在肝癌、乳腺中低表达发挥抑癌的作用,而在肺癌中高表达发挥促癌的作用。然而MOF在子宫内膜癌中的生物学功能尚不明确,还需进一步阐明。子宫内膜癌是常见的女性生殖道恶性肿瘤,按照发病机制和生物学行为特点分为两种类型。子宫内膜癌患者中约80%属于I型子宫内膜癌,此种类型与体内高雌激素状态、肥胖及雌激素受体(Estrogen Receptorα,ERα)阳性表达相关,且多为子宫内膜样腺癌。雌激素受体α(ERα)是配体依赖的转录因子,主要通过接受雌激素的刺激而发挥生物学功能。ERα在子宫内膜癌这类雌激素相关的肿瘤中参与调节雌激素诱导的细胞生长及增殖。然而,ERα在组织学分级为III级的子宫内膜癌标本中呈低表达,并且ERα的高表达与子宫内膜癌患者术后长期的无病生存有相关性。这些研究表明ERα在子宫内膜癌的进程中发挥重要而复杂的作用,尤其是ERα在组织学分级为较高级别(III级)的子宫内膜癌中表达降低的分子机制需深入解析。在本研究中,我们的目的旨在明确MOF在子宫内膜癌中的生物学功能,以及MOF与ERα在子宫内膜癌中的特征性表达、复杂功能的关联及相关分子机制,为研发子宫内膜癌治疗方法提供新靶点。研究方法:1、本研究首先通过功能学实验,在子宫内膜癌细胞及小鼠体内检测MOF在子宫内膜癌中的生物学功能。2、进一步在临床标本中运用免疫组化的方法分析MOF在200例子宫内膜癌组织与26例良性子宫内膜组织中的表达差异,及其与临床病理特征的关系。通过上述分析明确了MOF与ERα表达的关联,进而深入研究其中的分子机制。3、首先利用蛋白质免疫共沉淀实验验证MOF与ERα的相互作用。其次Western blot实验检测MOF过表达和敲低对ERα蛋白表达的影响。通过加入蛋白合成抑制剂CHX检测MOF和MOF突变体MOF K274R对ERα蛋白降解速度的影响;通过加入蛋白酶体抑制剂MG132检测MG132对敲低MOF引起的ERα蛋白表达减少的逆转作用。最后利用蛋白质免疫沉淀实验检测MOF及乙酰基转移酶活性失活的MOF突变体MOFK274R是否在细胞内乙酰化ERα,并检测其乙酰化ERα的赖氨酸位点。4、通过RNA microarray技术,从全基因组角度检测MOF与ERα共同调控的基因,并了解这些基因参与的功能范畴;再利用实时定量PCR和染色质免疫共沉淀(ChIP assay)实验进一步鉴定筛选出的MOF与ERα共同调控的基因。结果:1、敲低MOF促进了子宫内膜癌细胞的生长及增殖。生长曲线实验证实敲低MOF能够促进子宫内膜癌细胞(Ishikawa和HEC-1A细胞)的增殖。克隆形成实验证实,与对照组相比敲低MOF促进了细胞克隆形成的数量。流式细胞仪的实验结果表明,敲低MOF引起了G1期细胞减少及G2/M期细胞阻滞。小鼠荷瘤实验表明,与对照组相比敲低MOF组的子宫内膜癌细胞(Ishikawa细胞)在小鼠(雌性,NOD/SCID小鼠)体内形成更大的肿瘤,并且肿瘤的生长速度更快。2、在子宫内膜癌组织中,MOF呈低表达且与ERα的表达呈正相关。免疫组化结果表明,与良性子宫内膜组织相比MOF在子宫内膜癌组织(病理类型为子宫内膜样腺癌)中呈低表达(P0.01)。临床资料统计分析显示在子宫内膜癌组织(病理类型为子宫内膜样腺癌)中,MOF在Ⅲ级子宫内膜癌组织中呈低表达,且与ERα的表达呈正相关。Western blot实验检测了20例新鲜子宫内膜癌组织(病理类型为子宫内膜样腺癌)中MOF与ERα的表达情况。与免疫组化的结果一致,MOF与ERα的表达呈正相关。3、MOF与ERα相互作用并调节ERα蛋白的稳定性。蛋白质免疫共沉淀实验证实内源和外源的MOF与ERα在细胞内相互作用。共聚焦显微镜下观察,MOF主要定位在Ishikawa细胞的细胞核中。在雌激素存在的条件下,MOF与ERα部分共定位于Ishikawa细胞的细胞核中。Western blot实验证实敲低MOF并不影响ERαmRNA的表达,但ERα的蛋白表达降低。Western blot实验证实在加入蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)的条件下,MOF能够延缓ERα的蛋白降解,维持ERα蛋白的稳定,然而乙酰基转移酶活性失活的MOF突变体MOFK274R不能够维持ERα蛋白的稳定。蛋白酶体抑制剂MG132能够逆转由于敲低MOF引起的ERα蛋白表达的降低。蛋白质免疫沉淀实验表明ERα在子宫内膜癌Ishikawa细胞中能够被乙酰化,并且MOF与已报道的p300作用相似,能够在细胞内乙酰化ERα。然而,乙酰基转移酶酶活性失活的MOF突变体MOFK274R不能够乙酰化ERα。此外,根据已报道的p300乙酰化ERα的位点,我们构建了ERα的突变体:ERαK266R,ERαK268R,ERαK299R,ERαK302R,ERαK303R以及ERαK302R/K303R。蛋白质免疫沉淀实验表明与野生型的ERα乙酰化水平相比,ERα的突变体(K266R,K268R,K299R,K303R和K302R/K303R)乙酰化水平降低。4、在子宫内膜癌细胞中,MOF与ERα共同调控了一组内源基因。构建稳定敲低MOF的子宫内膜癌细胞及对照细胞,给予雌激素(E2)和不给予雌激素处理,共4组。通过RNA microarray技术,从全基因组角度检测4组之间的差异,实验结果表明雌激素(E2)调节的差异基因有1280个,MOF敲低组在有无雌激素(E2)刺激的条件下,分别有2807个和2054个差异基因。KEGG分析表明在雌激素(E2)存在的条件下,MOF影响的差异基因主要参与代谢通路,癌症通路,MAPK信号通路,细胞因子-细胞因子受体相互作用通路以及细胞周期通路。受雌激素(E2)调节的1280个基因中,在雌激素(E2)存在的条件下,敲低MOF组有18.8%(241个基因)的基因明显下调。进一步挑选在雌激素(E2)存在的条件下,明显受到MOF调节的且参与肿瘤进程的基因制成热图。利用实时定量PCR实验进一步确认了RNA microarray的筛选结果,其中受雌激素(E2)调控的DNA损伤相关自噬调节因子1(DRAM1)和TAGLN基因同时也受到MOF的调节。已知乳腺癌中的ERα下游靶基因PGR和E2F1在子宫内膜癌细胞中并不受MOF的明显调控。染色质免疫共沉淀实验(ChIP assay)证实在雌激素(E2)存在的条件下,MOF和ERα可以募集到DRAM1启动子雌激素作用元件Ⅰ区,通过调节组蛋白H4K16乙酰化水平调节DRAM1基因的转录。结论:1、MOF参与抑制子宫内膜癌细胞的生长及增殖。2、MOF在子宫内膜癌组织中呈低表达且与ERα的表达呈正相关。3、MOF与ERα在细胞内相互作用并通过乙酰化参与维持ERα蛋白的稳定。4、MOF和ERα在全基因组范围内共同调控了子宫内膜癌细胞中的一组内源基因。
【图文】：

癌组织,子宫内膜组织,免疫组化染色,子宫内膜癌

图 3.2 MOF 在子宫内膜癌组织中呈较低表达，且与 ERα 表达呈正相关A: 免疫组化染色表明与良性子宫内膜组织（BET）相比，MOF 在子宫内膜癌组织中表达较低。放大倍数，×40；标尺，50μm。B：MOF 在子宫内膜癌组织中的Hscore评分低于良性子宫内膜组织。箱式图的横线代表中位数，底部和顶部分别代表上四分位数和下四分位数；竖线代表数据的幅度范围。**，P<0.01。C：在较高级别的子宫内膜癌组织中（组织学分级为Ⅲ级）MOF的Hscore评分降低。**，P<0.01。D: western blot 实验检测新鲜冰冻子宫内膜癌组织中MOF与ERα的蛋白表达情况。E: MOF与ERα的蛋白表达在子宫内膜癌中呈正相关。利用ImageJ软件对western blot 条带（D）进行量化分析，将得到的灰度值采用SPSS17.0软件进行统计分析。运用SPSS进行Pearson相关性分析，，Pearson r值为0.6712，P=0.0012。

细胞内,免疫共沉淀,相互作用,抗体

图3.3.1 MOF与ERα在细胞内相互作用A：免疫共沉淀实验表明外源的FLAG-MOF能够与ERα在Ishikawa细胞内相互作用。Ishikawa细胞予以E2（10-8M）刺激与不刺激处理。利用anti-FLAG抗体或IgG（作为对照）进行免疫共沉淀实验，沉淀蛋白复合物用相应的抗体进行western blot分析。B：免疫共沉淀实验表明内源的MOF能够与ERα在Ishikawa细胞内相互作用。利用anti-MOF抗体或IgG（作为对照）进行免疫共沉淀实验，沉淀蛋白复合物用相应的抗体进行western blot分析。C: 共聚焦激光扫描显微镜下观察到MOF与ERα在Ishikawa细胞中共定位于细胞核。Ishikawa细胞予以E2（10-8M）刺激与不刺激处理。红色表示ERα的抗体染色，绿色表示MOF的抗体染色，蓝色为DAPI，用来定位细胞核。Merge为共定位的结果。标尺，10 。实验过程中我们发现在子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞和HEC-1A细胞中，MOF敲低并不影响ERα的mRNA表达，但是影响ERα的蛋白表达，实验结果表明当MOF表达减少时，ERα蛋白表达也降低（图3.3.2 A和B）。过表达MOF，ERα
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.33

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