高通量测序及相关技术在植入前遗传学诊断中的基础和应用研究

发布时间：2020-05-21 13:55

【摘要】：第一部分植入前遗传学诊断在单基因病中的临床应用研究目的:本研究旨在探讨多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)结合高通量测序(next generation sequencing,NGS)-单体型分析在单基因病植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)中的应用。材料与方法:采用MDA方法对活检的单细胞进行全基因组扩增,以基因突变为目标区域,在该突变上、下游选择若干单核苷酸多态性位点作为遗传标记,通过NGS技术进行植入前单体型分析(preimplantation halpotyping,PGH)和非整倍体筛查。所有胚胎单体型分析的结果经Sanger测序验证。结果:14个患者家系包括11种单基因遗传病,14名患者平均年龄31.7±5.5岁。通过控制性超促排卵(Control Ovarian Stimulation,COS)共获卵193个,其中卵子成熟率为84.5%(163/193),受精率为83.4%(136/163),卵裂率为98.5%(134/136)。14个家系通过单体型预实验的有效SNP位点一共984个。共活检72枚胚胎,经胚胎单体型和染色体拷贝数检测,正常胚胎比例为22.2%(16/72)。72枚胚胎中未获诊断胚胎比例为6.9%(5/72),检测的72枚胚胎中有4枚胚胎被检测到发生了重组,所占比率为5.6%。所有胚胎单体型分析的结果经Sanger测序验证,二者一致性为100%。14名患者有3例尚未移植,5例无可移植胚胎,6例已移植。移植的6例患者中一共4例获得成功妊娠(先天性遗传性耳聋、婴儿神经轴索营养不良、苯丙酮尿症和肾上腺脑白质营养不良家系),有2例已成功足月分娩(先天性遗传性耳聋、婴儿神经轴索营养不良家系),婴儿均健康。另两例继续妊娠中。4名患者均为单胎妊娠。结论:MDA结合NGS-PGH方法可以帮助具有高遗传风险的单基因病家庭获得健康后代,达到优生优育的目的。NGS-PGH可以同时进行胚胎基因型和单体型的分析,是可信度高的PGH方法。第二部分嵌合体胚胎移植的价值及风险探讨目的:嵌合体胚胎是人类辅助生殖技术的早期胚胎中常见的现象,本研究将探讨嵌合体胚胎的临床价值。材料与方法:分析26对行PGD和PGS助孕移植夫妇(28个移植周期)移植嵌合体囊胚的染色体组成、临床妊娠结局以及羊水穿刺结果;将患者捐赠的4枚嵌合体囊胚分成内细胞团和滋养外胚层部分应用NGS方法再次分析。结果:28个移植嵌合体囊胚的PGD周期,临床妊娠10例(35.7%),18例未孕。10例临床妊娠中活产4例,婴儿均健康,1例继续妊娠中,5例发生早期流产。5例成功临床妊娠的患者中,3例羊水核型结果正常,1例羊水核型结果为染色体平衡易位,1例未行羊水穿刺。NGS再次分析4枚嵌合体囊胚,有3枚囊胚滋养外胚层和内细胞团诊断均正常,有1枚囊胚滋养外胚层诊断为正常,内细胞团诊断为嵌合体,染色体组成为:部分细胞7号染色体p21.3-p15.3区存在12.46Mb的缺失。结论:PGD和PGS周期中没有正常可移植胚胎时,可以尝试移植嵌合体胚胎,但必须充分告知患者移植嵌合体胚胎可能存在的风险,后续必须进行有创的产前诊断。第三部分KDM5C基因突变致X-连锁智力低下综合征的分子机制研究目的:在体外转录和蛋白水平研究一智力低下综合征家系KDM5C基因新发突变c.673del C的功能。材料与方法:构建KDM5C基因野生型和突变型质粒瞬时转染人神经元SH-SY5Y细胞系,荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR,QPCR)和蛋白质印迹(Western blot,WB)方法分别检测转染后KDM5C信使RNA(messenger RNA,m RNA)和KDM5C蛋白的表达,流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞系组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)三甲基化水平;同时利用si RNA瞬时转染此细胞系,流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞系H3K4三甲基化水平。结果:与转染野生型质粒的SH-SY5Y细胞系相比,转染突变型质粒组细胞系KDM5C的m RNA和蛋白表达明显减少,差异具有统计学意义(P0.05)。H3K4三甲基化水平在两个转染者之间比较无显著性差异(P0.05);转染si RNA组的SH-SY5Y细胞H3K4三甲基化水平与转染阴性对照相比无显著性差异(P0.05)。结论:KDM5C基因c.673del C突变降低了KDM5C的表达,但并不影响SH-SY5Y细胞整体H3K4三甲基化水平;干扰KDM5C基因的表达不影响SH-SY5Y细胞整体H3K4三甲基化水平。
【图文】：

囊胚,胚胎,单精子显微注射,胚胎培养

胚胎培养和囊胚活检，A：卵胞浆内单精子显微注射（×200 倍C：卵裂期胚胎（×400 倍）；D：囊胚活检（×400 倍）Embryo culture and blastocyst biopsy，A：intracytoplasmic sperm；C：cleavaged embryo；D：biopsied blastocyst8.2 活检细胞收集和囊胚冷冻）提前吸 2 μL PBS 至 0.2 ml PCR 管中，将活检的细胞暂离心。同时准备空白对照，直接在 PCR 管中放入 2）活检后胚胎行玻璃化冷冻保存。活检后胚胎置于平衡液 ES 中预平衡 5 min，然后移入玻胚胎从玻璃化液中移入冷冻载杆，套上外套管迅速放，冷冻载杆编号和胚胎编号一一对应。8.3 多重置换扩增）准备 Buffer DLB：对 Buffer DLB 管进行离心处理使

囊胚,后囊,胚胎,患者

4）反应结束后，电泳跑胶，目的片段长度区域测序。5）测序完成后，用 DNASTAR-Lasergene v6 分析结果4.10 胚胎解冻移植解冻 1 枚正常胚胎，B 超引导下移植入患者子宫。移植第 1430 天和 65 天嘱患者分别做阴道超声以确认是否为临床妊娠及功妊娠，妊娠 18 周行羊水穿刺验证 PGD 和 PGS 诊断结果。1 枚正常胚胎，直至妊娠。若正常胚胎解冻移植完，，均未妊娠是否愿意再次行 PGD 治疗，让患者自主选择。图 1-2 为解冻
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.8

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