miR-206通过靶定BAG3表达抑制宫颈癌细胞增殖、迁移与侵袭

发布时间：2020-05-24 18:21

【摘要】：前言宫颈癌是全球女性最常见的一种生殖道恶性肿瘤。据统计,每年约有50万的新发病例,其中绝大多数出现在发展中国家。我国每年的新发病例约占世界总数的 1/3。目前,宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)已被公认为宫颈癌的癌前病变,而高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)的持续感染则可诱使大约1%的CIN患者进展为宫颈癌。据统计,从CIN到宫颈癌发生约要8-10年,由此表明宫颈癌的发生涉及多种因素的共同作用。因此,本文致力于阐明宫颈癌的潜在分子机制,探寻宫颈癌细胞中异常表达的分子在宫颈癌的发生、发展及淋巴转移中的机理;研究结果将有助于宫颈癌靶向药物的开发与应用。microRNA(miRNAs)已被报道为一种非编码RNA,其长度约为19～23个核苷酸。近几十年来,miRNAs在许多恶性肿瘤中起着致癌基因或抑癌基因的作用。一般来说,miRNA抑制肿瘤相关基因的转录,并通过结合相应mRNA的3'非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)的互补序列下调其表达。值得注意的是,miR-206可以通过靶定多种mRNA的3'-UTR调节不同靶基因的表达,并在细胞分化、增殖和凋亡等多种细胞过程中发挥着重要的作用。本课题组前期的研究证实,Bcl2相关永生基因3(Bcl2-associatedathanogene 3,BAG3)也参与了宫颈癌的多种生物学过程,包括细胞增殖、迁移和侵袭。BAG3拥有Bag结构域,可结合到HSP22蛋白,识别应激等条件下细胞中错误折叠蛋白,依靠巨细胞自噬途径促进错误折叠的蛋白降解,维持蛋白稳态,抵抗细胞凋亡,促进肿瘤细胞的发生发展。然而,miR-206/BAG3通路在宫颈癌中的作用仍然是未知的。在这项研究中,本组将检测宫颈鳞癌组织和宫颈癌细胞株SiHa和HeLa中miR-206与BAG3的表达,然后通过体外和体内实验探索miR-206和BAG3对宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭的作用。最后,我们将评估BAG3是否是miR-206的有效靶点。本文旨在探讨miR-206与BAG3在宫颈癌中的表达及临床意义、在宫颈癌细胞中的分子机制以及在裸鼠移植瘤中的调控作用,为未来可能的临床应用奠定理论基础。第一部分miR-206与BAG3在宫颈鳞癌组织中的表达及意义目的:明确miR-206、BAG3 mRNA及其蛋白在宫颈鳞癌组织及癌旁正常组织中的表达水平;探究miR-206、BAG3 mRNA或蛋白与宫颈鳞癌患者的临床病理资料的相关性,尤其与宫颈鳞癌FIGO分期、盆腔及腹主动脉旁淋巴结转移的相关性。方法:本组首先收集50例新鲜宫颈鳞癌的临床样本,之后提取新鲜宫颈癌组织及邻近癌旁组织的总RNA与总蛋白;分别采用RT-PCR与实时荧光定量PCR技术分析miR-206与BAG3 mRNA的表达情况;利用Western blot检测BAG3蛋白的表达情况;统计分析miR-206与BAG3的关系,明确二者与宫颈鳞癌患者临床病理资料的相关性;重点分析miR-206、BAG3表达与盆腔及腹主动脉旁淋巴结转移的相关性。结果:1.与宫颈癌旁正常组织的表达水平相比,miR-206在子宫颈鳞癌组织中的表达水平明显降低,而BAG3 mRNA或蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达水平显著上调;差异具有统计学意义(P0.01)。2.与没有发生盆腔及腹主动脉旁淋巴结转移的宫颈鳞癌样本相比,miR-206在发生转移的宫颈鳞癌样本中表达显著下调;然而,BAG3 mRNA及其蛋白在发生转移的宫颈鳞癌样本中表达明显上调;差异具有统计学意义(P0.01)。3.宫颈鳞癌组织中,miR-206的表达水平与临床FIGO分期、盆腔及腹主动脉旁淋巴结转移均明显负相关(P0.05);而与患者的年龄、肿瘤直径均无相关性(P0.05)。另外,BAG3 mRNA和蛋白的表达水平与临床分期、盆腔及腹主动脉旁淋巴结转移状态均呈明显正相关(P0.05);而与患者的年龄、肿瘤直径均无相关性(P0.05)。4.线性回归与相关性分析发现,miR-206表达与BAG3 mRNA或蛋白呈现明显的负相关性(R2=0.841,P0.001;R2=0.766,P0.001)。结论:1.miR-206在宫颈鳞癌组织中表达下调,BAG3 mRNA及其蛋白在宫颈鳞癌组织中表达上调,提示miR-206在宫颈鳞癌中可能作为抑癌基因,而BAG3可能作为致癌基因发挥作用。2.miR-206与BAG3二者负相关且与FIGO分期和淋巴结转移明显相关,提示二者可能参与了宫颈鳞癌的侵袭和转移过程。第二部分 miR-206通过靶定BAG3表达影响宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭目的:1.鉴于miR-206与BAG3在宫颈癌组织中的表达以及负相关性,本部分将通过体外实验深入研究miR-206与BAG3对宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响以及二者的靶定关系。2.通过动物实验探究miR-206对宫颈癌细胞生长增殖的影响,并对其中的相关机制进行探讨,旨在明确miR-206在宫颈癌恶化进程中的作用机理,为寻找新的分子标志物和药物靶点奠定基础。方法:1.体外培养SiHa和HeLa细胞,RT-PCR与实时荧光定量PCR法检测miR-206与BAG3 mRNA的表达,Western Blot法检测BAG3蛋白的表达。2.miR-206模拟物(mimics)或对照mRNAs(miR-NC)转染SiHa和HeLa细胞,CCK-8法分析宫颈癌细胞增殖。3.通过伤口愈合和Matrigel的Transwell法明确miR-206对细胞迁移和侵袭能力的影响。4.生物信息学与双荧光素酶报告基因分析miR-206与BAG3的靶定关系;5.构建BAG3稳定过表达或BAG3 siRNA(si-BAG3)沉默的慢病毒并感染SiHa和HeLa细胞,通过共转染miR-206模拟物或miR-NC,分析干扰BAG3的表达是否能够逆转miR-206对癌细胞生物学作用。6.将SiHa细胞随机分为四组:miR-206+si-BAG3转染组;miR-206+si-control转染组;miR-NC+si-BAG3转染组;miR-NC+si-control转染组。荧光定量PCR检测细胞中miR-206与BAG3的表达。将各组细胞分别接种裸鼠皮下,建立裸鼠宫颈癌移植瘤模型,观察裸鼠成瘤情况。游标卡尺测量瘤体大小,计算移植瘤体积及重量,绘制瘤体体积的折线图。Western blot检测瘤体内BAG3蛋白的表达水平。结果:1.miR-206、BAG3在宫颈癌细胞中的表达与正常细胞相比,miR-206在SiHa和HeLa细胞表达明显降低(P0.01)。另一方面,BAG3 mRNA和蛋白在SiHa和HeLa细胞中的表达相比于正常细胞明显增加(P0.01)。2.miR-206抑制宫颈癌细胞增殖CCK-8检测显示,与对照组相比,miR-206过表达有效降低SiHa和HeLa细胞增殖(P0.01)。同时,免疫印迹法检测细胞增殖相关蛋白,包括EGFR、Bcl-2和Bax蛋白;结果发现,与对照组相比,miR-206模拟物显著降低了 SiHa和 HeLa细胞中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和Bcl-2的蛋白表达(P0.01)。相反,与对照组相比,转染miR-206模拟物的SiHa和HeLa组中Bax蛋白表达显著升高(P0.01)。3.miR-206抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭伤口愈合实验分析显示,miR-206过表达明显抑制SiHa和HeLa细胞的迁移能力(P0.01)。此外,Transwell实验分析表明,与对照组相比,miR-206过表达明显抑制SiHa和HeLa细胞侵袭能力(P0.01)。Western blot检测侵袭相关蛋白后结果显示,miR-206模拟物明显降低SiHa和HeLa细胞中MMP2和MMP9的蛋白表达(P0.01)。4.BAG3的3'-UTR是miR-206的直接靶点双荧光素酶报告基因结果显示,miR-206模拟物显着降低野生型组(BAG3-3'UTR-wt)细胞的荧光强度,且呈剂量依赖性(P0.01),而miR-206模拟物没有改变突变组(BAG3-3'UTR-mut)细胞的荧光强度(P0.05)。Western blot分析显示,共转染miR-206模拟物和3'-UTR-wt的SiHa与Hela细胞株中,BAG3蛋白表达明显降低,而在共转染miR-206模拟物和3'-UTR-mut的SiHa与Hela细胞株中BAG3蛋白表达未见明显改变(P0.05)。5.BAG3过表达部分逆转了miR-206的抑制作用BAG3过表达有效地提高了 SiHa和HeLa细胞中BAG3蛋白表达。CCK-8分析显示,BAG3过表达促进SiHa和HeLa细胞增殖,部分逆转了miR-206抑制的细胞增殖(P0.01)。伤口愈合以及Transwell实验分析表明,BAG3过表达也部分逆转了miR-206模拟物抑制的SiHa和HeLa细胞迁移与侵袭(P0.01)。6.降低BAG3表达部分促进miR-206的抑制作用BAG3 siRNAs对BAG3蛋白表达有明显的抑制作用。CCK-8分析表明,与其余组相比,miR-206模拟物连同BAG3 siRNA更有效抑制了 SiHa和HeLa细胞的增殖(P0.01)。伤口愈合以及Transwell实验分析表明,与空白对照、单独miR-206模拟物或单独BAG3 siRNA处理组相比,miR-206模拟物连同BAG3 siRNA共转染有效抑制了SiHa和HeLa细胞的迁移与侵袭(P0.01)。7.miR-206抑制了裸鼠移植瘤的生长各组的瘤内含miR-206模拟物或si-BAG3的裸鼠均正常存活14天。Western blot检测结果显示,相比于miR-NC或沉默对照组,miR-206模拟物或si-BAG3显著抑制BAG3表达(P0.01)。此外,miR-206模拟物和si-BAG3共同抑制BAG3蛋白的表达(P0.01)。肿瘤体积的统计分析表明,miR-206模拟物或si-BAG3转染组的肿瘤体积明显小于对照组(P0.01)。14天后,各组切除的移植瘤称重分析的结果表明,miR-206模拟物或si-BAG3转染组的肿瘤重量明显低于对照组(P0.01)。值得注意的是,与其余三组相比,miR-206模拟物与si-BAG3的共转染组表现出了最低的肿瘤重量和体积(P0.01)。结论:1.miR-206在宫颈癌中可能作为抑癌基因,抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和移植瘤的形成。BAG3在宫颈癌中可能作为致癌基因,促进宫颈癌细胞增殖、迁移与侵袭。2.miR-206通过靶定BAG3表达影响宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和移植瘤的形成。miR-206的上调或BAG3的沉默可分别或共同抑制移植瘤的生长。
【图文】：

宫颈,宫颈鳞癌,半定量分析

图１．邋ｍ邋ｉ邋Ｒ－２０６与ＢＡＧ３在宫颈鳞癌组织中的表达逡逑Ａ：邋ＲＴ－ＰＣＲ检测并半定量分析ｍｉＲ－２０６在宫颈淲癌和癌旁正常组织中的表逡逑达；Ｂ：邋ＲＴ－ＰＣＲ检测并半定量分析ＢＡＧ３ｍＲＮＡ在宫颈淲癌和癌旁正常组织中逡逑的表达；Ｃ：邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ并半定量分析检测ＢＡＧ３蛋白在宫颈淲癌和癌旁正常逡逑组织中的表达。逡逑

载体质粒,靶点,图谱,转染

混合均句，用相应的培养液调整终浓度为５９ｇ／ｍＬ。之后，加入到调整好浓度的混合液中，目的是有效提升转染的效率。、逡逑（３）用移液器全部吸取培养皿中的细胞培养液，同时，加入ｌｍＬ好的上述混合液，过夜。另外，，用移液器全部吸取培养皿中的培养液后，不含Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ的混合培养液，继续培养，换液，传代。２ｄ后，我们素筛选成功转染慢病毒颗粒的细胞。逡逑（４）逦２－３邋ｄ的时间换一次含嘌呤霉素的培养液，最后将得到稳定Ｂ细胞株；空白对照的转染步骤同上；Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ鉴定转染的细胞。逡逑５．邋ＢＡＧ３相关表达载体的构建逡逑（１）首先，我们用Ｋｐｎｌ和Ｘｈｏｌ两种限制性核酸内切酶对骨架质酶切后的产物将会用琼脂糖凝胶电泳的方法进行回收，酶切后的片大小（图１）。逡逑Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｐｏｌｙ（Ａ）逡逑逦ｓｉ门邋ａｌｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎａｌ逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33

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