Sohlh2在卵巢癌干细胞分化中的作用及其作用机制的研究

发布时间：2020-05-24 20:10

【摘要】：研究背景:卵巢癌是目前女性生殖系统肿瘤中发病率居于第三位但死亡率居首位的疾病,大约90%为上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC),其重要的临床特征包括起病隐匿、易扩散转移、高耐药性和高复发,使妇女的生命健康受到严重的威胁。由于卵巢癌缺乏早期症状,大部分患者就诊时处于肿瘤晚期,严重影响患者的生存率和生活质量,目前为止卵巢癌的治疗依旧是临床的难题。因而,探寻卵巢癌复发转移和耐药的发生机制,以及早期诊疗的新靶点,是卵巢癌研究的热点领域。肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)是少数拥有自我更新能力的肿瘤细胞,具有易扩散、高耐药、高致瘤等特征。CSCs被认为是肿瘤发生发展、产生侵袭转移以及复发耐药的根本原因。基于以上理论,从卵巢癌干细胞的角度探讨卵巢癌的发生发展、侵袭转移以及复发耐药的机制,是治疗卵巢癌的新策略。Sohlh2(Spermatogenesis and oogenesis basic helix-loop-helix transcription factor2)是碱性螺旋-环-螺旋家族的重要成员,广泛表达于正常人体组织,如卵巢、乳腺和结肠等。Sohlh2在多种肿瘤细胞中的表达明显低于相应的正常组织。我们前期的实验结果显示,卵巢癌组织中Sohlh2呈低表达,并与肿瘤的分期和分级呈负相关。过表达Sohlh2可以通过下调cyclinD1、mmp9等基因的表达,抑制卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭以及裸鼠皮下移植瘤的生长和转移。上述结果提示,Sohlh2作为一个抑癌基因,参与卵巢癌发生发展的调控。Sohlh2是否参与卵巢癌干细胞增殖分化的调控,尚未见报道。Wnt/β-catenin信号通路的过度激活是导致卵巢癌发生发展的一个重要机制,已证实,卵巢癌干细胞中激活Wnt/β-catenin信号通路,可明显促进CSCs增殖。β-catenin分子是该信号通路的关键分子,被异常激活的调节因子通过各种方式最终引起胞质中β-catenin增加,继而导致β-catenin入核与转录因子TCF/LEF结合,促进下游靶基因C-myc、cyclinD1、MMP9等的表达,在卵巢癌发生发展、复发转移和耐药中发挥重要的调控作用。我们利用干细胞培养基富集卵巢癌干细胞,通过基因转染、RNA干扰、FACS、RT-PCR、免疫荧光染色、Western Blot、裸鼠皮下移植瘤等实验技术,探讨Sohlh2在卵巢癌干细胞增殖分化中的作用以及对CSCs中Wnt/β-catenin信号通路的调控。研究方法:1.检测Sohlh2对上皮性卵巢癌干细胞分化的影响(1)Sohlh2对上皮性卵巢癌细胞干性特征的影响体外培养卵巢癌细胞系HO8910和Skov3细胞,慢病毒转染Sohlh2过表达和shRNA质粒,建立稳转Sohlh2过表达或敲减卵巢癌细胞系。将HO8910细胞分为①Con组;②P-Sohlh2组;③CSCCon组;④CSCP-Sohlh2组四个组,将Skov3细胞分为①Si-Con组;②Si-Sohlh2组;③CSC Si-Con组;④CSC Si-Sohlh2组四个组,利用干细胞克隆形成实验、FACS、顺铂耐药实验检测Sohlh2对卵巢癌细胞干性特征的影响。(2)检测Sohlh2对上皮性卵巢癌干细胞标记蛋白表达的影响采用实时定量PCR、免疫荧光和Western Blot实验,检测HO8910四组细胞(Con,P-Sohlh2,CSC Con,CSC P-Sohlh2)和 Skov3 四组细胞(Si-Con,Si-Sohlh2,CSC Si-Con,CSC Si-Sohlh2)干细胞标志物CD44、SOX2基因表达水平的变化。2.在体检测Sohlh2对卵巢癌干细胞裸鼠皮下成瘤以及皮下肿瘤组织中卵巢癌干细胞的分化的影响通过裸鼠皮下成瘤实验,在体检测Sohlh2对卵巢癌干细胞分化的影响。将HO8910两组细胞(CSC Con,CSC P-Sohlh2)分别注射到同一裸鼠皮下不同部位,定期观察皮下肿瘤的生长情况,记录不同阶段肿瘤团块的大小。实验结束后处死裸鼠并取出肿瘤组织,称瘤重。通过免疫组化染色和Western Blot实验,检测皮下肿瘤中CD44和SOX2表达状况。3.探讨Sohlh2影响卵巢癌干细胞分化的作用机制(1)通过 Western Blot 技术,检测 HO8910 四组细胞(Con,P-Sohlh2,CSC Con,CSC P-Sohlh2)和 Skov3 四组细胞(Si-Con,Si-Sohlh2,CSC Si-Con,CSC Si-Sohlh2)中Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin、C-myc、cyclinD1基因在蛋白水平的表达。(2)通过Western Blot和免疫组织化学检测裸鼠皮下肿瘤组织中β-catenin、C-myc、cyclinDl基因在蛋白水平的表达。(3)通过Western Blot实验检测添加Wnt/β-catenin信号通路激动剂(B4818)和阻断剂(A8217)后C-myc、CD44、SOX2基因在蛋白水平的表达。4.检测卵巢癌组织中Sohlh2、SOX2、β-catenin、C-myc的表达相关性利用卵巢癌组织芯片,通过免疫组织化学染色,分析卵巢癌组织中Sohlh2、SOX2、β-catenin、C-myc 表达的相关性。研究结果:1.(1)经干细胞培养基诱导富集成球后,HO8910细胞CSCP-Sohlh2组干细胞球的数目和大小明显小于CSC Con组;而Skov3细胞CSC Si-Sohlh2组组细胞球的数量和大小明显大于CSC Si-Con组。FACS实验结果显示,经干细胞培养基诱导富集成球后,CSC P-Sohlh2组干细胞百分比明显低于CSC Con组(p0.01)。耐药实验结果显示,在不同浓度顺铂作用48 h后,MTT结果显示,HO8910细胞P-Sohlh2过表达组OD值明显低于Con组(p0.05),Skov3细胞Si-Sohlh2组OD值明显高于Si-Con组(p0.05)。(2)实时定量PCR结果显示,在HO8910细胞,与Con组细胞相比,P-Sohlh2组 CD44、SOX2、OCT4 的 mRNA 水平明显降低;与 CSC Con 相比,CSC P-Sohlh2组CD44、SOX2、OCT4的mRNA水平也明显降低;而在Skov3细胞中敲低Sohlh2后,Si-Sohlh2 组和 CSC Si-Sohlh2 组 CD44、SOX2、OCT4 的 mRNA 水平明显高于相应的对照组。免疫荧光染色结果显示,在HO8910细胞,CSC P-Sohlh2组的CD44的荧光强度弱于CSC on组;在Skov3细胞,CSC Si-Sohlh2组荧光强度比C比C Si-Con组强。Western Blot实验结果显示,与Con组相比,P-Sohlh2组CD44、SOX2蛋白水平降低;与CSC Con相比,CSC P-Sohlh2组CD44、SOX2蛋白水平也降低。而敲减 Sohlh2 后,Si-Sohlh2 组和 CSCSi-Sohlh2 组 CD44、SOX2蛋白水平明显高于相应的对照组。2.裸鼠皮下成瘤实验结果显示,CSC P-Sohlh2组皮下肿瘤的生长速度明显慢于对照组;CSC P-Sohlh2组形成肿瘤的平均重量明显低于CSC Con组。免疫组织化学染色和Western Blot实验结果显示,肿瘤组织中CSC P-Sohlh2组CD44、SOX2的蛋白表达明显降低。上述实验结果提示,Sohlh2抑制在体卵巢癌干细胞的增殖,促进其分化。3.免疫组织化学染色和Western Blot实验结果显示,在卵巢癌细胞和裸鼠皮下成瘤组织中,Sohlh2过表达,下调了 Wnt/β-catenin信号通路的β-catenin及其靶基因C-myc、cyclinD1的蛋白表达。相反,Sohlh2敲低后,靶基因C-myc、cyclinD1的表达在蛋白水平显著上调。体外培养的卵巢癌干细胞中添加Wnt/β-catenin信号通路激动剂(B4818)或阻断剂(A8217)作用24h后,Western Blot结果显示,Wnt/β-catenin信号通路介导Sohlh2对C-myc、CD44、SOX2基因表达的调控。4.卵巢癌组织芯片免疫组化结果显示,卵巢癌组织中Sohlh2的表达与SOX2、β-catenin和C-myc的表达呈负相关。结论:1、Sohlh2可促进卵巢癌干细胞的分化。2、Sohlh2通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活发挥作用。
【图文】：

卵巢癌,裸鼠,肿瘤组织,免疫组织化学染色

为检测Ｓｏｈｌｈ２对裸鼠皮下肿瘤组织中卵巢癌干细胞分化的作用，进行了免逡逑疫组织化学染色和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ实验。结果显示Ｓｏｈｌｈ２过表达组ＣＤ４４、ＳＯＸ２逡逑的蛋白表达明显低于Ｃｏｎ组（图４）。逡逑３３逡逑

卵巢癌组织,免疫组化,相关关系

织中Ｓｏｈｌｈ２的表达较低时，Ｓ０Ｘ２的表达较高、ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ和Ｃ－ｍｙｃ的核内表达逡逑也较高；反之，，Ｓｏｈｌｈ２表达较高时，Ｓ０Ｘ２的表达较低、卩－ｃａｔｅｎｉｎ和Ｃ－ｍｙｃ的核逡逑内表达也较低（图８）。逡逑Ｓｏｈｌｈ２逦ＳＯＸ邋２逦Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ逦Ｃ－ｍｙｃ逡逑ｍ逡逑ｖ逦■，，邋－逦：１逦＾邋；邋－邋Ｖ，邋；；＜邋－逡逑图８免疫组化结果显示卵巢癌组织中Ｓｏｈｌｈ２与Ｓ０Ｘ２、（Ｊ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｃ－ｍｙｃ表达之逡逑间的相关关系逡逑３７逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31

【参考文献】