【摘要】：骨关节炎(osteoarthritis,OA)是以关节软骨的退行性病变为主要病理特征的慢性关节疾病。传统观点认为,OA主要是增龄、创伤、劳损等因素引起的关节软骨退化损伤,而近期研究表明,OA属于代谢综合征(metabolic syndrome,MS)的范畴。Barker等在上世纪90年代率先报道,低出生体重儿成年后MS的发病率增加,并提出“成人疾病发育起源”学说。流行病学研究也表明,男性低出生体重者发生手部OA的比例明显高于对照组,女性也有类似的趋势。提示OA可能存在胎儿发育起源。研究表明,OA的发生与关节软骨质量密切相关。哺乳动物关节软骨的主要成分为细胞外基质和少量软骨细胞。软骨基质主要由Ⅱ型胶原(α1 chain oftypeⅡ collagen gene,Col2a1)和蛋白聚糖(Aggrecan,ACAN)等物质组成,光滑且有一定韧性,具有润滑和缓冲的重要作用,但是软骨内缺乏血管,软骨细胞代谢速度慢,生理情况下关节软骨基质更新极慢。软骨在受到损伤时难以自行修复,软骨本身的发育情况对于软骨的疾病抵抗力极为重要。大部分关节软骨在胎儿时期就已经发育成熟,因此胎儿时期宫内环境因素对软骨发育的影响决定了成熟软骨的质量,并可能影响其成年后OA的发生风险。转化生长因子β(transforming growth factor β,TGFβ)信号通路参与了软骨细胞基质合成过程。TGFβ可以与其受体TGFβRⅡ结合激活经典的TGFβ/Smads信号级联通路。Y染色体性别决定结构域转录因子(SRY-type high mobility group box9,Sox9)是软骨形成的起始因子,在软骨发生和发育过程中与软骨表型基因的增强子区结合,促进软骨表型基因表达并维持软骨细胞特性。TGFβ-Smad2/3-Sox9通路在软骨基质的合成过程中起到了关键作用。地塞米松(dexamethasone,DEX)是一种合成糖皮质激素(glucocorticoid,GC),能轻易通过胎盘,被广泛应用于有早产风险的孕妇,降低新生儿呼吸窘迫综合征的发生风险。然而,孕期暴露于地塞米松不仅可导致胎儿的宫内发育迟缓,而且可导致其子代成年后多种代谢性疾病易感。成年高血压、2型糖尿病、精神系统疾病及代谢综合征等疾病都与胎儿时期糖皮质激素过暴露导致的相关基因编程改变有关。那么孕期地塞米松暴露(prenatal dexamethasone exposure,PDE)是否具有关节软骨发育毒性呢?跨代遗传指亲代(F0代)孕期宫内环境的变化,导致F1代胚胎和产生F2代的生殖细胞系直接暴露于不良环境因素,而F3代未直接暴露,但生殖细胞系可能发生表观基因组变化并传递下去,导致相关疾病表型传递至F3代。近期有流行病学调查和实验室研究报道,孕期不良环境(如孕期摄食限制、尼古丁暴露等)不仅造成F1代胰岛形态改变或哮喘易感,而且可遗传至F2代甚至F3代,具有跨代遗传效应。本实验室前期研究也发现,孕期咖啡因暴露致子代神经内分泌代谢编程改变可遗传至F2代。那么PDE对子代关节软骨的影响是否具有跨代遗传效应呢?其跨代遗传机制如何呢?MicroRNAs(miRNAs)是一类小分子非编码RNAs,长度约21-25个核苷酸。成熟的miRNAs通过与相应的靶标mRNAs的3'-非编码区(3'-untranslated region,3'-UTR)结合介导mRNA降解或抑制mRNA翻译。已知miR-92a-3p能靶向调控组蛋白去乙酰化酶2(histonedeacetylase2,HDAC2)的表达。研究表明,相比于正常关节软骨,在OA软骨中miR-92a-3p表达显著降低,HDAC2在OA软骨中活性显著增加,介导了软骨细胞基质合成基因的表达抑制。基于上述研究报道,我们推测,PDE可能通过抑制子代生殖细胞系miR-92a-3p表达,介导了 HDAC2高表达,导致各子代关节软骨软骨TGFβ信号通路低乙酰化低表达,软骨基质合成功能抑制,最终导致子代关节软骨质量低下的跨代遗传。本研究将以PDE大鼠模型为研究对象,阐明PDE致子代大鼠关节软骨质量低下的跨代遗传现象,并从表观遗传修饰角度阐述关节软骨质量低下跨代遗传的可能机制。为此,本课题将进行以下研究:①在整体水平,证实PDE所致雌性子代大鼠关节软骨质量低下的跨代遗传现象;②在细胞水平,证实地塞米松通过抑制miR-92a-3p表达介导大鼠原代胎软骨细胞TGFβ信号通路低功能,导致软骨洗白基质合成功能低下;③在整体水平,证实卵母细胞miR-92a-3p低表达介导孕期地塞米松暴露所致的雌性子代大鼠关节软骨质量低下的跨代遗传效应。第一部分PDE致雌性子代大鼠关节软骨质量低下的跨代遗传效应目的:在整体动物水平,观察PDE对雌性F1/F2/F3代大鼠关节软骨质量的影响,并探讨关节软骨TGFβ信号通路在其中发挥的作用。方法:Wistar孕鼠随机分为对照组和PDE组。PDE组孕鼠自孕9天(gestational day 9,GD9)起至GD20止予以地塞米松0.8 mg/kg/d皮下注射,对照组给予等体积的生理盐水皮下注射。分别在F1-GD20和F1代出生后12周(postnatal week 12,PW12)经异氟烷麻醉处死后获取雌性子代大鼠血清和膝关节标本。其余各组子代大鼠出生后给予正常饮食饲养,出生后12周龄大鼠按照雌雄比=2:1合笼(雌雄鼠来自不同的父母),分别获得F2和F3代雌性大鼠PW12时期膝关节标本。采用高效液相色谱法检测F0代孕鼠及F1代胎鼠血清地塞米松浓度;部分F1代宫内及F1/F2/F3代成年子代大鼠膝关节标本经固定包埋后行关节软骨HE染色和番红O-固绿染色,观察关节软骨病理形态学改变;免疫组织化学检测关节软骨COL2A1和TGFβ/TGFβR1/Smad2/Sox9蛋白表达情况;其余膝关节标本剥离膝关节面软骨组织,提取软骨组织总RNA,利用实时荧光定量PCR检测关节软骨COL2A1和ACAN表达以及TGFβ信号通路相关基因表达。结果:①血地塞米松浓度:PDE组母血地塞米松浓度为0.864μmol/L,子代胎血地塞米松浓度为0.26μmol/L,为母血浓度的31.6%,提示母血地塞米松能够透过胎盘屏障进入胎血循环中;②关节软骨形态变化:HE染色及番红O固绿染色提示,与对照组相比,PDE组F1-GD20/F1-PW12/F2-PW12/F3-PW12时期关节软骨均表现为染色变浅,静止区厚度变薄,软骨细胞数量相对降低,排列结构紊乱;③软骨基质合成功能:与对照组相比,PDE组F1-GD20/F1-PW12/F2-PW12/F3-PW12时期均见软骨基质合成基因COL2A1和ACAN的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P0.05,P0.01);④关节软骨TGFβ信号通路表达情况:与对照组相比,PDE组F1-GD20/F1-PW12/F2-PW12/F3-PW12时期,均表现为TGFβ/TGFβR1/Smad2/3/Sox9的mRNA和蛋白低表达水平(P0.05,P0.01)。结论:PDE可导致雌性子代大鼠F1/F2/F3代关节软骨质量持续低下,表现为关节软骨细胞外基质合成功能降低,各代关节软骨TGFβ信号通路低表达可能介导了关节软骨质量低下的现象。第二部分地塞米松致大鼠胎软骨细胞基质合成功能低下的表观遗传机制目的:在大鼠原代胎软骨细胞水平,探究地塞米松对软骨细胞基质合成功能的影响,并探究其表观遗传机制。方法:取大鼠原代胎软骨细胞进行培养,分别给予0,20,100,500,2500nM地塞米松处理,24h后收集细胞,检测细胞增殖率、miR-92a-3p、HDAC2表达,TGFβ信号通路、Col2a1/Aggrecan表达及乙酰化水平;分别对miR-92a-3p过表达和抑制,检测其靶基因HDAC2表达变化;通过质粒转染过表达TGFβR1,检测下游基质合成基因表达变化。结果:①MTS结果:以20,100,500,2500nM地塞米松作用于胎关节软骨1天后,软骨细胞活力与对照组相比没有显著改变;②与对照组相比,地塞米松处理组TGFβ信号通路基因TGFβ/TGFβR1/SMAD2/SMAD3以及软骨基质合成基因COL2A1/ACAN的mRNA表达呈浓度依赖性降低,而TGFβR1过表达后,软骨基质合成基因COL2A1和ACAN表达显著升高(P0.05,P0.01);③地塞米松可通过升高HDAC2显著降低软骨细胞TGFβ通路及下游基质合成基因启动子区H3K9ac水平④。与对照组相比,地塞米松处理组miR-92a-3p表达显著降低,HDAC2表达显著升高(P0.05,P0.01);胎软骨细胞经miR-92a-3p mimic处理后,miR-92a-3p表达升高,HDAC2表达抑制;胎软骨细胞经anti-miR-92a-3p处理后,miR-92a-3p表达抑制,HDAC2表达升高;结论:地塞米松通过抑制miR-92a-3p表达,使HDAC2表达上调,导致软骨细胞TGFβR1及COL2A1基因启动子区乙酰化水平降低,抑制软骨细胞TGFβ信号通路及基质合成功能。第三部分卵母细胞miR-92a低表达介导PDE雌性子代软骨质量低下的跨代遗传效应目的:在整体动物水平,探究卵母细胞表遗传修饰改变在大鼠关节软骨质量低下跨代遗传中的作用。方法:采用孕马血清促性腺激素—人绒毛膜促性腺激素(PMSG-HCG)对正常对照组和PDE组F1和F2代雌性Wistar大鼠进行超排卵处理,收集大鼠卵母细胞样本,检测卵母细胞miR-92a-3p表达量;取F1/F2/F3代关节软骨样本,检测miR-92a-3p靶基因HDAC2的表达水平;进一步检测关节软骨TGFβ通路关键基因及软骨基质合成基因组蛋白乙酰化水平。结果:①与对照组相比,PDE组卵母细胞miR-92a-3p表达水平显著降低(P0.05,P0.01);②与对照组相比,在 F1-GD20、F1-PW12、F2-PW12、F3-PW12时期,PDE组关节软骨HDAC2表达水平显著升高(P0.05,P0.01);③与对照组相比,在 F1-GD20、F1-PW12、F2-PW12、F3-PW12 时期,PDE 组TGFβ/TGFβR1/SOX9/COL2A1/ACAN基因启动子区组蛋白H3K9乙酰化水平均显著降低(P0.05,P0.01)。结论:PDE通过抑制卵母细胞miR-92a-3p表达跨代编程关节软骨TGFβ通路低乙酰化水平,导致关节软骨质量低下的跨代遗传效应。
【图文】：
大鼠关节软骨质量低下的跨代遗传效应，并且从软骨细胞基质合成障碍的角度证逡逑实其表观遗传调控机制，从生殖细胞的角度阐明其可能的跨代遗传机制。本项目逡逑的研究假说（图１－１）：孕期地塞米松暴露抑制ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ表达，使其靶基因逡逑ＨＤＡＣ２表达升高，导致ＴＧＦＰ信号通路和Ｃｏｌ２ａｌ／Ａｇｇｒｅｃａｎ启动子区发生组蛋白逡逑去乙酰化修饰，使软骨细胞ＴＧＦＰ信号通路和Ｃｏｌ２Ａｌ／Ａｇｇｒｅｃａｎ表达降低，最终逡逑导致关节软骨发育不良，造成成年关节软骨质量低下；宫内地塞米松所致的这种逡逑表观遗传修饰改变可能通过生殖细胞传递至后代，导致关节软骨质量低下的跨代逡逑编程效应。本研究的意义在于阐明地塞米松软骨发育毒性及其跨代遗传效应的表逡逑观遗传修饰机制，为阐明０Ａ的发病机制提供新的思路。＜逡逑４逡逑
ＨＥ染色结果表明，对照组关节软骨表面平整，结构清晰，软骨细胞排列整逡逑齐，，细胞数量丰富，未见明显细胞增生，各层胶原排列整齐，而ＰＤＥ组关节软逡逑骨虽未见明显结构紊乱，但其软骨基质染色变淡，软骨细胞数减少（图３－２邋Ａ）。逡逑番红０固绿染色结果显示，与对照组相比，ＰＤＥ组大鼠关节软骨染色着色变淡，逡逑关节软骨各层结构紊乱，分界不清，关节软骨表层肥大化软骨细胞增多，ＰＤＥ逡逑组ＭＯＤ值显著降低（Ｐ＜０．０５邋Ｘ图３－２邋Ｂ，邋Ｄ）。免疫组化结果显示，ＰＤＥ组ＣＯＬ２Ａ１逡逑蛋白表达显著降低，ＭＯＤ值下降（Ｐ＜０．０５）（图３－２Ｃ，Ｅ）。ＲＴ－ｑＰＣＲ结果显示，逡逑与对照组相比，ＰＤＥ组关节软骨细胞基质合成基因ＣＯＬ２Ａ１及ＡＣＡＮ的ｍＲＮＡ逡逑表达水平显著降低（Ｐ＜0．0５）（图３－２Ｆ）。以上结果提示，孕期地塞米松暴露后，逡逑Ｆ１代雌性大鼠出生后１２周关节软骨质量仍持续低下，表现为关节软骨机制含量逡逑降低。逡逑１７?
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R715.3
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