miR-3162-5p对人宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响及其靶基因的初步研究

发布时间：2020-05-25 23:39

【摘要】：目的:探讨miR-3162-5p对人宫颈癌(Cervical cancer,CC)SiHa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。生物信信息学预测miR-3162-5p的潜在靶基因,筛选靶基因富集的高分通路,初步分析验证RAS信号通路中miR-3162-5p的潜在靶基因。方法:构建重组慢病毒miR-3162-5p模拟物(miR-3162-5p-LV)、miR-3162-5p模拟物空载组(LV-NC)、miR-3162-5p抑制物(miR-3162-5p-IN)、miR-3162-5p抑制物空载组(IN-NC),分别转染宫颈癌SiHa细胞。采用CCK-8法对比转染miR-3162-5p-LV、LV-NC及miR-3162-5p-IN、IN-NC后SiHa细胞增殖能力的区别;划痕实验对比转染miR-3162-5p-LV、LV-NC及miR-3162-5p-IN、IN-NC后SiHa细胞迁移能力区别;Transwell实验对比转染miR-3162-5p-LV、LV-NC及miR-3162-5p-IN、IN-NC后SiHa细胞迁移、侵袭能力区别。检索各microRNA数据库如miRBase、miRWalk、miRTarBase等,运用Targetscan在线生物软件预测miR-3162-5p的可能靶基因。检索多个信号通路网站如KEGG、STRING、COREMINE等,运用生物信息软件microRNA pathway分析通路阈值,选择靶基因富集数目排名靠前的信号通路;运用Oncomine网络在线免费芯片数据库,查询靶基因富集数目最多的信号通路上所有可以在KEGG上搜索到的基因在宫颈癌组织和非癌组织中的差异表达情况;利用STRING和Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)和从PPI中模块分析;根据GEPIA在线数据库关联已有临床分析,应用GEPIA的相关Kaplan-Meier曲线逐个查询关键基因在CC患者中总体生存率和无病生存率,筛选出有统计学意义的关键基因;根据生存分析结果,针对有统计学意义关键基因,运用免疫组织化学S-P法初步验证这些基因在CC癌组织和非癌组织中的表达情况;RASA4是一个作用于RAS信号通路上GDP/GTP循环的RasGAP家族的一个分子,用Western blot验证转染了miR-3162-5p-LV、LV-NC、miR-3162-5p-IN、IN-NC后SiHa细胞RASA4蛋白表达的区别。结果:转染miR-3162-5p-LV后,宫颈鳞癌SiHa细胞的增殖、迁移能力均增高;转染miR-3162-5p-IN后,宫颈鳞癌SiHa细胞的增殖、迁移能力有所下降;CCK-8法对比转染miR-3162-5p-LV后SiHa细胞增殖能力增高(p0.05),转染miR-3162-5p-IN后SiHa细胞增殖能力下降(p0.05);划痕实验对比SiHa细胞转染miR-3162-5p-LV后迁移能力增高(p0.05),转染miR-3162-5p-IN后迁移能力下降(p0.05)。综合各个microRNA pathway在线数据库分析,得出miR-3162-5p靶基因富集于RAS信号通路的数目最多(34个);在KEGG上查找RAS信号通路上的所有基因,随后用Oncomine芯片数据库筛选出RAS信号通路在宫颈癌组织和正常宫颈组织中存在差异表达的基因,其中有统计学意义的差异表达基因77个,包括31个高表达基因、42个低表达基因和4个在Oncomine芯片数据库不同数据集中既存在高表达又存在低表达情况的差异基因;通过STRING和Cytoscape构建的蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)和模块分析中得到RAS通路中在宫颈癌组织和非癌组织中差异表达的关键基因24个。关联临床上有关于24个关键基因的生存分析,结果显示:FGFR2、GNG7、IGF1、GNB5、PTPN11和VEGFA突变的宫颈癌患者总体生存率较差,KITLG和PTPN11突变的宫颈癌患者无病生存率较差;免疫组织化学结果表示PTPN11在宫颈癌组织中存在高表达的趋势;Western blot实验显示转染miR-3162-5p-LV的SiHa细胞RASA4蛋白表达降低,转染miR-3162-5p-IN的SiHa细胞ASA4蛋白表达升高。结论:miR-3162-5p对人宫颈癌SiHa细胞的增殖和迁移能力有促进作用;miR-3162-5p调控RAS信号通路促进宫颈癌发生、发展、转移;PTPN11、RASA4可能是miR-3162-5p调控的RAS信号通路的靶基因,RASA4低表达、PTPN11高表达都有可能是miR-3162-5p调控RAS通路促进CC发生、发展、转移的其中机制。
【图文】：

1（A）U6 的扩增曲线，（B）miRNA-3162-5p-LV、LV-NC、miRNA-3162-5p-IN扩增曲线，，黄色为 miRNA-3162-5p-LV 组、蓝色为 LV-NC 组、红色为 SiHa 组62-5p-IN、紫色为 IN-NC-1 （A）The amplification curves of U6，(B)the amplification curves of miRNA-3iRNA-3162-5p-LV、LV-NC and SiHa. Yellow for miRNA-3162-5p-LV, blue for LVn for miRNA-3162-5p-IN, purple for IN-NC

2-3 miRNA-3162-5p 在各细胞中的相对表达量，miR-3162-5p-LV 2-5p-IN、IN-NC 组和 SiHa 组相比，其 miR-3162-5p 表达量明显高于.2-3 The relative expression of miRNA-3162-5p in each group. The3162-5p in miR-3162-5p-LV was significantly higher than that in LV-NC IN-NC group、SiHa group (P < 0.001) 荧光显微镜下 SiHa 细胞的形态1）荧光显微镜下未经嘌呤霉素筛选的 SiHa 细胞的
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33

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本文编号：2680919