FOXM1通路对浆液性卵巢癌恶性行为的影响及其机制研究

发布时间：2020-05-27 02:12

【摘要】：卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。由于缺乏有效的筛查手段且早期症状不明显,绝大多数患者就诊时已届晚期。大约70%患者在经过标准治疗后会复发,5年总体生存率仅为47%左右。浆液性卵巢癌是最常见、恶性程度高的亚型,占卵巢癌的70%左右。浆液性卵巢癌包括高级别和低级别两种类型。高级别浆液性卵巢癌是浆液性卵巢癌中最常见的类型,其致死人数约占所有浆液性卵巢癌死亡人数的70-80%。浆液性卵巢癌发现晚及治疗难仍然是全球面临的难题,究其原因主要在于浆液性卵巢癌的发生及病理机制仍未阐明。2011年美国癌症与肿瘤基因组计划(The Cancer Genome Atlas,TCGA)在Nature发表了卵巢癌全基因组分析成果,研究者发现FOXM1信号通路在87%的高级别浆液性卵巢癌中异常活化,仅次于TP53突变(96%)。FOXM1及其增殖相关的靶基因AURKB、CCNB1、BIRC5、CDC25和PLK1均在高级别浆液性卵巢癌中异常高表达,提示FOXM1可能在浆液性卵巢癌的发生发展过程中发挥重要作用。FOXM1是一个典型的与增殖相关的转录因子,其作为细胞有丝分裂必需成分通过调控G1-S及G2-M期转换促进细胞增殖。FOXM1在多种人类恶性肿瘤中过度表达,FOXM1可以促进恶性转化,参与肿瘤的发生,发展,包括促进血管生成、迁移、浸润、上皮间质转化、干细胞的自我更新、化疗耐药等多个过程。作为肿瘤研究中的明星分子,FOXM1在浆液性卵巢癌中异常高表达的原因及相关调控机制尚不清楚。在浆液性卵巢癌中FOXM1与哪些分子相互作用,通过哪些关键的下游靶基因参与肿瘤的发生、发展等问题均未得到完全阐明。因此阐释FOXM1异常高表达的调控机制及其下游关键靶基因在浆液性卵巢癌发生、发展中的功能和相关分子机制对该疾病的诊断、治疗及预后判断将起到至关重要的作用。本课题拟系统研究FOXM1通路对浆液性卵巢癌恶性行为的影响及其机制,具体研究内容包括以下三部分:第一部分FOXM1在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能研究研究目的FOXM1在乳腺癌、肝癌、肺癌和胰腺癌等多种人类恶性肿瘤中高表达。FOXM1广泛参与恶性肿瘤的增殖、转移、恶性转化、血管生成、DNA损伤以及肿瘤干细胞的自我更新等多个生物学过程。本课题组浆液性卵巢癌和正常输卵管伞表达谱芯片结果发现FOXM1在浆液性卵巢癌中的表达较正常输卵管伞中增加5.2倍。本部分旨在研究确定FOXM1在浆液性卵巢癌中的表达情况,通过体外细胞实验确定FOXM1在浆液性卵巢癌中发挥的生物学功能并利用构建的浆液性卵巢癌组织芯片免疫组化染色评价FOXM1的临床预后价值。研究内容及方法使用Oncomine及TCGA数据分析FOXM1在正常卵巢、腹膜与浆液性卵巢癌组织中的表达差异。使用qRT-PCR、western blot检测FOXM1 mRNA和蛋白在正常输卵管伞和浆液性卵巢癌组织或者正常输卵管伞上皮细胞及卵巢癌细胞系中的差异表达。使用 TCGA、Oncomine 及 Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)数据分析浆液性卵巢癌中FOXM1拷贝数对FOXM1表达的影响,同时评价FOXM1拷贝数变化对临床预后的影响。使用TCGA数据及Kaplan-Meier Plotter网站分析FOXM1与浆液性卵巢癌临床预后的关系。使用本课题组构建的浆液性卵巢癌组织芯片的免疫组化染色确定FOXM1在浆液性卵巢癌组织中的表达状况,并通过与临床预后进行相关性分析确认FOXM1在浆液性卵巢癌临床应用的前景。根据FOXM1在卵巢癌细胞系中的表达差异,构建FOXM1过表达及干扰的慢病毒载体并建立相应的细胞系。通过CCK8增殖实验、平板克隆形成实验及transwell功能实验研究FOXM1对卵巢癌细胞及输卵管伞上皮细胞增殖、转移的影响。利用western blot检测FOXM1对卵巢癌细胞周期相关蛋白及上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关分子的影响。研究结果Oncomine和TCGA数据分析显示FOXM1在浆液性卵巢癌中的表达明显高于正常卵巢或者腹膜组织。qRT-PCR结果表明FOXM1在浆液性卵巢癌组织或者卵巢癌细胞中mRNA表达高于正常输卵管伞组织或细胞。Western blot结果发现FOXM1在浆液性卵巢癌组织或者卵巢癌细胞中蛋白表达高于正常输卵管伞组织或细胞。FOXM1三种剪接异构体中FOXM1C在浆液性卵巢癌中的表达最高,FOXM1B次之,FOXM1A的表达最低。卵巢癌TCGA数据分析发现,FOXM1在11%的浆液性卵巢癌样本中存在异常拷贝数扩增,FOXM1拷贝数扩增样本较未扩增样本中FOXM1 mRNA和蛋白表达均增加。Oncomine数据显示FOXM1在浆液性卵巢癌中的拷贝数明显高于正常卵巢组织或血液。CCLE数据分析发现在45种卵巢癌细胞中FOXM1拷贝数的变化与其mRNA和蛋白表达存在相关性。卵巢癌TCGA数据分析发现FOXM1拷贝数扩增患者的总生存期及无进展生存期低于未存在拷贝数扩增的患者。Kaplan-Meier Plotter网站分析FOXM1与临床预后关系的显示FOXM1高表达的卵巢癌患者预后不良。FOXM1在本课题组构建的浆液性卵巢癌组织的免疫组化染色发现:FOXM1阳性染色分布在细胞核和细胞浆;FOXM1在卵巢癌中的染色强度高于正常输卵管伞组织;FOXM1高表达的比例达到82.09%(110/134),FOXM1低表达的比例为17.91%(24/134),FOXM1高表达患者总生存期明显低于FOXM1低表达患者(p0.01)。根据FOXM1在卵巢癌细胞系中的差异表达构建FOXM1过表达及干扰的细胞系。细胞功能实验结果表明:过表达FOXM1后卵巢癌细胞的克隆形成、增殖及侵袭迁移的能力增强;干扰FOXM1后卵巢癌细胞的克隆形成、生长及侵袭迁移的能力明显减弱。人输卵管上皮细胞FTE187过表达FOXM1B后细胞生长及迁移的能力明显增强。以上结果表明FOXM1可以明显促进卵巢癌细胞及输卵管上皮细胞的增殖和转移。Western blot实验结果发现在HO8910细胞干扰FOXM1后E-cadherin表达上调;N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug表达下降。此外,FOXM1干扰后CCNB1表达下降。研究结论FOXM1在浆液性卵巢癌中高表达,与其不良临床预后相关。FOXM1促进浆液性卵巢癌恶性生物学行为,有望成为卵巢癌治疗的重要靶点。第二部分浆液性卵巢癌中FOXM1下游靶基因的筛选鉴定与功能研究研究目的FOXM1在人类恶性肿瘤中表达普遍增加,FOXM1异常高表达与恶性肿瘤的发生和进展密切相关。尽管目前已经发现了一些FOXM1的靶基因,但是FOXM1驱动的绝大多数下游靶基因仍然不清楚。由于恶性肿瘤具有极大的异质性,单个信号通路或下游靶基因不足以解释FOXM1促进恶性肿瘤发生发展的机制。在浆液性卵巢癌中FOXM1通过哪些关键的下游靶基因参与肿瘤的发生、发展等问题均未得到完全阐明。因此阐释FOXM1下游关键靶基因在浆液性卵巢癌发生、发展中的功能和相关分子机制对该疾病的早期诊断和治疗将起到至关重要的作用。本部分旨在通过ChIP-seq筛选鉴定FOXM1在浆液性卵巢癌中执行促癌功能的关键下游靶基因并研究其表达、临床意义及生物学功能。研究内容及方法通过分析文献中乳腺癌细胞MCF7使用FOXM1抑制剂硫链丝菌素及DMSO对照后的ChIP-seq结果得到FOXM1可以结合的下游靶基因,随后与本课题组浆液性卵巢癌表达谱芯片取交集后,初步筛选到FOXM1在浆液性卵巢癌中可能调控的关键靶基因。使用卵巢癌TCGA数据进一步验证靶基因表达。通过构建FOXM1干扰的卵巢癌细胞系,使用qRT-PCR和western blot鉴定FOXM1干扰后mRNA和蛋白水平明显变化的下游靶基因。使用TCGA和CCLE数据分析浆液性卵巢癌组织和卵巢癌细胞系中FOXM1和下游靶基因表达的相关性。使用qRT-PCR检测浆液性卵巢癌组织中FOXM1和下游靶基因表达的相关性。利用gene-regulation网站分析靶基因启动子上FOXM1潜在结合位点,使用双荧光素酶报告基因实验研究FOXM1能否直接激活靶基因表达。使用ChIP-PCR进一步验证FOXM1是否可以结合到靶基因启动子上。利用qRT-PCR和western blot研究靶基因在浆液性卵巢癌临床样本及卵巢癌细胞系中的表达。使用Kaplan-Meier Plotter网站分析靶基因与临床预后的关系。使用本课题组构建的浆液性卵巢癌组织芯片进行免疫组化染色验证,结合临床预后及临床参数进行相关性分析确认靶基因在浆液性卵巢癌临床应用上的前景。通过构建靶基因干扰或者过表达细胞系,通过CCK8增殖实验、平板克隆形成实验及transwell实验研究靶基因对卵巢癌细胞增殖及转移的影响。研究结果通过分析使用ChIP-seq数据及结合浆液性卵巢癌与正常输卵管伞组织的表达谱芯片筛选到多个基因作为FOXM1在浆液性卵巢癌中可能调控的候选下游靶基因:TOP2A、TROAP、CCNA2、KIF20A、ASPM、HMGB2、CCNB1、TTF2以及CCNF。卵巢癌TCGA数据进一步验证发现以上基因在浆液性卵巢癌中的表达上调。qRT-PCR及western blot实验进一步验证后显示卵巢癌细胞HO8910、SKOV3 和 OVCAR3 干扰 FOXM1 后 CCNF 和 KIF20A 均明显下降。卵巢癌TCGA数据分析显示FOXM1和CCNF表达呈中度相关(r=0.68,p0.01)。CCLE数据同样显示在多种卵巢癌细胞中FOXM1和CCNF的表达正相关(r=0.4096,p0.01)。qRT-PCR结果发现FOXM1和CCNF在浆液性卵巢癌组织中的mRNA表达呈中度相关(r=0.5235,p0.01)。使用gene-regulation预测FOXM1可能结合到CCNF启动子上的两个潜在结合位点。双荧光素酶报告基因实验显示FOXM1主要通过结合到CCNF启动子的转录结合位点2(TFBS2)激活CCNF转录,转录结合位点1(TFBS1)发挥作用比较微弱。ChIP-PCR验证了 FOXM1可以直接结合CCNF启动子的TFBS2。qRT-PCR和western blot结果表明CCNF在浆液性卵巢癌中的mRNA及蛋白表达明显高于正常输卵管伞组织。Kaplan-Meier Plotter网站分析CCNF与临床预后的关系显示CCNF高表达与卵巢癌患者的预后不良相关。CCNF在浆液性卵巢癌组织芯片中的免疫组化染色发现:CCNF阳性染色主要集中在细胞核,CCNF高表达的比例为44.95%(49/109),CCNF高表达患者的总生存期明显低于低表达患者(p0.05)。根据CCNF在卵巢癌细胞中的差异表达构建CCNF过表达及干扰细胞系。细胞功能实验结果表明:CCNF过表达后促进卵巢癌细胞的克隆形成、增殖及侵袭迁移;CCNF干扰后抑制卵巢癌细胞的克隆形成、生长及转移。在FOXM1过表达的A2780中干扰CCNF后FOXM1促进侵袭的能力明显减弱。卵巢癌TCGA数据分析显示:KIF20A在浆液性卵巢癌中的表达明显高于正常卵巢组织;FOXM1和KIF20A表达存在中度相关(r=0.66,p0.01)。CCLE数据显示多种卵巢癌细胞中FOXM1和KIF20A表达存在相关性(r=0.3855,p0.01)。qRT-PCR的结果表明KIF20A在新鲜浆液性卵巢癌组织中的表达明显高于正常输卵管伞组织。The human protein atlas网站分析KIF20A免疫组化染色同样证实KIF20A在卵巢癌中染色较强,其阳性染色主要集中在细胞核。Kaplan-Meier Plotter网站分析KIF20A与临床预后的关系显示KIF20A高表达患者的总生存期及无进展生存期明显低于KIF20A低表达患者。根据KIF20A在卵巢癌细胞系中的差异表达构建KIF20A干扰的细胞系。CCK8增殖实验及transwell实验结果显示SKOV3及OVCAR3细胞中干扰KIF20A后卵巢癌细胞的增殖及侵袭能力下降。研究结论FOXM1在浆液性卵巢癌中通过调控CCNF和KIF20A发挥促癌功能。CCNF和KIF20A在浆液性卵巢癌中高表达,与其不良预后相关。第三部分FOXM1在浆液性卵巢癌中的上游分子调控机制研究研究目的可变剪接是基因调控和蛋白多样性的主要调控机制。近些年的研究发现大约有95%的人类多外显子基因存在可变剪接。可变剪接与包括人类恶性肿瘤在内的多种疾病密切相关。异常剪接可以导致抑癌基因失活或者原癌基因激活。剪接体相关因子CTNNBL1在本课题组前期研究中发现其在浆液性卵巢癌中的表达明显高于正常输卵管伞,并且与临床预后相关。此外,在干扰CTNNBL1前后的表达谱芯片中发现CTNNBL1干扰后可以影响包括FOXM1在内的多个重要基因的可变剪接。在大约50%的人类恶性肿瘤中存在TP53突变。卵巢癌TCGA数据显示TP53突变比例高达96%,FOXM1在大约87%的样本中存在异常活化。有研究指出,野生型p53可以直接结合到FOXM1启动子上抑制其表达。我们由此推测,浆液性卵巢癌中FOXM1异常高表达是否与突变型TP53相关;野生型p53由于突变失活后对FOXM1表达的抑制作用减弱,浆液性卵巢癌中突变型p53是否通过抑制野生型p53促进FOXM1表达;浆液性卵巢癌中具有获得性功能(Gain of function,GOF)p53突变是否可以促进FOXM1表达。本部分的研究旨在从可变剪接和TP53调控两个方面阐释FOXM1在浆液性卵巢癌中高表达的原因。一方面通过研究剪接体相关因子CTNNBL1在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能及进一步明确CTNNBL1对FOXM1可变剪接的调控机制。另一方面通过生物信息学及体外实验初步研究TP53突变与FOXM1表达的相关性。研究内容及方法使用western blot检测CTNNBL1在正常输卵管伞和浆液性卵巢癌组织或卵巢癌细胞中的表达差异。使用TCGA及Oncomine数据分析CTNNBL1在正常卵巢和浆液性卵巢癌组织中的表达、基因变异和拷贝数差异。通过本课题组构建的浆液性卵巢癌组织芯片免疫组化染色评价CTNNBL1表达及其与临床预后、临床参数的关系。使用TCGA数据分析CTNNBL1基因变异及表达及对临床预后的影响。构建CTNNBL1过表达或者干扰细胞系,通过细胞功能实验研究CTNNBL1对卵巢癌细胞增殖、转移等方面的影响。使用 Affymetrix Human HTA 2.0 分析干扰 CTNNBL1 干扰前后 CTNNBL1调控的下游基因及相应的剪接事件。构建FOXM1迷你基因研究CTNNBL1是否可以通过调控FOXM1可变剪接的方式影响FOXM1表达。使用Oncomine及TCGA数据分析TP53与FOXM1表达的相关性。通过浆液性卵巢癌组织免疫组化染色评价p53和FOXM1表达的相关性。体外细胞实验检测过表达TP53突变后FOXM1表达的变化。研究结果Western blot实验发现CTNNBL1蛋白在浆液性卵巢癌组织中呈现高表达,其在绝大多数卵巢癌细胞中的表达同样高于正常输卵管伞上皮细胞。卵巢癌TCGA数据分析显示:CTNNBL1 mRNA表达高于正常卵巢组织;浆液性卵巢癌中CTNNBL1 DNA拷贝数变异明显高于正常卵巢组织;CTNNBL1拷贝数变异与其mRNA表达明显正相关。CTNNBL1在浆液性卵巢癌组织芯片中的免疫组化染色发现:CTNNBL1阳性染色主要集中在细胞核,CTNNBL1高表达的比例为56.25%(72/128),CTNNBL1高表达患者的总生存期明显短于低表达患者(p0.05)。CTNNBL1表达与网膜转移存在相关性(p0.05)。卵巢癌TCGA数据分析发现:21%浆液性卵巢癌样本存在CTNNBL1基因变异(65/316),其中16.1%(51/316)样本是mRNA上调,1%样本是基因组拷贝数变异(3/316),CTNNBL1基因变异患者较无基因变异患者的总生存期明显缩短;CTNNBL1高表达患者的总生存期明显低于CTNNBL1低表达患者。平板克隆及CCK8增殖实验表明CTNNBL1过表达后卵巢癌细胞克隆形成和增殖能力明显增强;干扰CTNNBL1后癌细胞的克隆形成和增殖能力明显减弱。HO8910细胞干扰CTNNBL1后可以使细胞周期阻滞在G1期,相应western blot实验发现HO8910干扰CTNNBL1后细胞周期蛋白CCND1和CCNE表达均下降。划痕实验和transwell实验表明CTNNBL1过表达后促进卵巢癌细胞侵袭及迁移的能力;干扰CTNNBL1后癌细胞侵袭和迁移的能力明显减弱。Western blot实验检测了 CTNNBL1对EMT相关分子表达的影响:CTNNBL1干扰后可以不同程度下调Slug、Snail、MMP2及p-catenin等分子的同时上调E-cadherin表达。剪接芯片结果显示剪接体相关因子CTNNBL1调控包括FOXM1在内的多种剪接事件。TCGA数据表明CTNNBL1和FOXM1表达呈正相关。Western blot结果显示卵巢癌细胞中干扰CTNNBL1后FOXM1蛋白表达下降。qRT-PCR结果表明卵巢癌细胞干扰CTNNBL1后FOXM1A表达上调,FOXM1B和FOXM1C表达均降低。体外剪接实验显示,在HEK293T中共转迷你基因pcDNA3.1-VIIa 和 CTNNBL1 小干扰后 FOXM1A 表达上调,FOXM1B 和FOXM1C表达明显下调。Hendrix卵巢癌数据发现TP53突变卵巢癌中FOXM1表达增加,免疫组化结果显示FOXM1在p53阳性染色卵巢癌中的表达高于p53阴性染色样本。卵巢癌TCGA数据分析发现:与野生型TP53浆液性卵巢癌样本相比,突变型TP53样本中FOXM1 mRNA和蛋白表达增加;具有GOF TP53突变(如R175H、R273H、R248Q、R273C、R282W、Y220C 等)浆液性卵巢癌中FOXM1 mRNA和蛋白表达总体上高于野生型TP53样本;具有GOF TP53突变浆液性卵巢癌样本与未有GOF TP53样本中FOXM1 mRNA和蛋白表达未有明显差异,但均高于野生型TP53样本中的表达。本课题组关于FOXM1和TP53的浆液性卵巢癌组织的免疫组化染色分析发现FOXM1表达与p53突变相关(p0.01)。Western blot 实验发现使用 TP53 siRNA 干扰 A2780(p53 wild type)后FOXM1蛋白表达相应升高,而使用nutlin3a激活p53后FOXM1蛋白表达相应下降。qRT-PCR检测SKOV3(p53 null)细胞中过表达突变及野生型TP53后,除TP53突变(R248Q)外FOXM1mRNA表达与对照组未有明显差异。但是western blot实验发现SKOV3细胞中过表达突变及野生型TP53后,突变型TP53(R248Q和R282W)细胞中FOXM1蛋白表达增加。研究结论CTNNBL1通过调控FOXM1的可变剪接影响其表达。FOXM1在浆液性卵巢癌中高表达与TP53突变相关。
【图文】：

图３．生存分析显示ＦＯＸＭＩ表达与浆液性卵巢癌的临床预后相关逡逑（Ａ）邋ＴＣＧＡ数据分析ＦＯＸＭ１拷贝数扩增对患者总生存期的影响。（Ｂ）逡逑ＴＣＧＡ数据分析ＦＯＸＭ１拷贝数扩增对患者无进展生存期的影响。（Ｃ）逡逑Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ邋Ｐｌｏｔｔｅｒ网站分析卵巢癌中ＦＯＸＭ１表达与无进展生存期的关系。逡逑

图４．邋ＦＯＸＭ１促进卵巢癌细胞的克隆形成及生长逡逑（Ａ－Ｂ）平板克隆形成实验检测ＦＯＸＭ１对卵巢癌细胞克隆形成能力的影响。逡逑（Ｃ－Ｄ）邋ＣＣＫ８增殖实验检测ＦＯＸＭ１对卵巢癌细胞生长的影响。＊ｐ＜０．０５，，逡逑＊＊＾＜０．０１邋0逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31


本文编号：2682782