剪接因子PQBP1促进卵巢癌发生发展的作用机制

发布时间：2020-05-28 13:19

【摘要】：卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤,病死率一直位居妇科恶性肿瘤之首。高级别浆液性卵巢癌(High-grade Serous Ovarian Cancer,HGSOC)是恶性程度最高的亚型,占卵巢癌的70%～8 0%,且具有发病隐匿、侵袭能力强、预后差等特点。大多数卵巢癌患者由于缺乏特异性症状和早期筛查方法,发现时多已确诊为晚期,常死于肿瘤复发和耐药,晚期患者的5年生存率仅为20%～30%。因此,阐明卵巢癌发生发展的分子机制,筛选有效的分子靶点,对于卵巢癌的早期诊断和治疗具有重要意义。异常的选择性剪接在恶性肿瘤发生发展中起到重要作用,肿瘤细胞通过异常的选择性剪接产生有利于肿瘤增殖、凋亡、缺氧、血管生成、免疫逃逸和转移等行为的剪接异构体,进而促进肿瘤的发生发展。卵巢癌中异常剪接的分子机制与癌症进展密切相关。课题组通过转录组及蛋白质组学分析发现。与卵巢癌发生发展相关的信号通路中,剪接体通路排在首位,进一步分析134个主控剪接因子,发现有33个在卵巢癌中上调,提示异常的选择性剪接在卵巢癌中发挥关键作用。卵巢癌中存在许多基因转录本的差异剪接,在卵巢癌细胞中CD44s高表达,CD44v低表达,CD44s通过下调剪接因子ESRP1介导TGFβ1诱导的EMT通路,从而诱导卵巢癌细胞侵袭迁移,随后获得干细胞样特征和耐药;骨桥蛋白(OPN)转录本OPNc在卵巢癌中特异性表达,而不是OPNa或OPNb,促进卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭、体内肿瘤形成等恶性行为;Bcl-x是凋亡基因bcl-2家族的一员,Bcl-x基因的pre-mRNA选择性剪接产生Bcl-xS和Bcl-xL,这两种亚型分别与促进和抑制凋亡有关,Bcl-xL的过表达抑制肿瘤细胞凋亡、促进转移和化疗耐药并与不良临床预后有关,而Bcl-xS可诱导细胞凋亡,使细胞对化疗药物敏感。多聚谷氨酰胺结合蛋白 1,即PQBP1(polyglutamine binding protein 1,PQBP1)是课题组发现的在卵巢癌中表达上调的剪接因子之一,是一个进化上高度保守的智力发育相关蛋白,其突变会导致X染色体相关的“Renpenning综合征”。PQBP1与RNA聚合酶Ⅱ等转录因子相互作用参与转录调控。除此之外,PQBP1与多个剪接因子相互作用,参与人类细胞中许多基因mRNA的选择性剪接。功能缺失的PQBP1降低了 SF3B1与底物mRNA的关联,导致选择性剪接模式发生显著变化。PQBP1在卵巢癌中表达水平上调,但是在卵巢癌发生发展中发挥怎样的作用,具体参与了哪些异常剪接事件,还有待进一步研究。研究目的本课题拟明确PQBP1在HGSOC中的表达;探究PQBP1在卵巢癌细胞的增殖、侵袭迁移、凋亡等恶性生物学行为中发挥怎样的作用;最后明确剪接因子PQBP1调控的下游靶基因和选择性剪接事件。研究方法qPCR、Western blotting及免疫组化检测卵巢癌中PQBP1的表达情况;TCGA数据库分析表达情况及临床预后;分子生物学方法构建PQBP1慢病毒过表达质粒、慢病毒敲低质粒,建立PQBP1过表达、敲低稳转细胞系;平板克隆、MTT、EdU实验证明PQBP1对卵巢癌细胞增殖的影响,Western blotting检测周期相关蛋白的表达;Transwe11实验探究PQBP1对卵巢癌细胞侵袭迁移的影响,Western blotting实验检测EMT通路蛋白的表达情况;流式细胞术检测PQBP1对卵巢癌细胞凋亡的影响,Western blotting检测凋亡蛋白的表达;RT-PCR、qPCR检测PQBP1对内源性Bcl-x基因选择性剪接的影响;构建Bcl-x minigene质粒,RT-PCR方法检测PQBP1对外源性Bcl-x基因选择性剪接的影响。研究结果1.PQBP1在卵巢癌中显著高表达并与患者预后相关课题组前期转录组及蛋白质组学分析发现剪接因子PQBP1在卵巢癌中高表达。收集正常输卵管伞组织16例,高级别浆液性卵巢癌组织29例进行验证,qPCR结果显示PQBP1在高级别浆液性卵巢癌中普遍高表达(*P0.05),TCGA数据分析发现,卵巢癌中PQBP1存在基因扩增及mRNA高等变异(1 1%),并且PQBP1的高表达与卵巢癌患者预后差正相关(p=0.025)。2.PQBP1促进卵巢癌细胞增殖、侵袭迁移、体内成瘤等恶性行为利用慢病毒系统构建PQBP1高表达和低表达稳转细胞系,用于功能实验研究。平板克隆实验显示过表达PQBP1能够明显增强卵巢癌细胞克隆形成能力,敲低PQBP1能够明显降低卵巢癌细胞克隆形成能力;MTT实验显示过表达PQBP1能够促进卵巢癌细胞增殖,敲低PQBP1能够降低卵巢癌细胞增殖;检测周期相关蛋白的表达,发现敲低PQBP1的细胞p53和p21表达升高,CyclinD1、CyclinE表达下调。以上实验结果说明PQBP1在体外能够显著促进卵巢癌细胞的增殖。为进一步研究PQBP1在卵巢癌中的生物学功能,课题组利用Transwe1l实验检测PQBP1对卵巢癌细胞侵袭力的影响,发现过表达PQBP1增强卵巢癌细胞侵袭力,而敲低PQBP1则降低卵巢癌细胞侵袭迁移能力,证明PQBP1促进卵巢癌细胞的侵袭转移,增加癌细胞的恶性程度。Western blotting检测了 EMT通路相关蛋白的表达,发现过表达PQBP1促进间质表达相关标记物Vimentin、P-Catenin、N-Cadherin、Claudin-1、Snail、Slug等蛋白的表达,降低上皮表达相关标记物E-Cadherin、ZO-1等蛋白的表达,敲低PQBP1反之。以上结果显示PQBP1促进卵巢癌细胞的侵袭及EMT进程。体内成瘤实验显示:相比于对照组,过表达PQBP1(HEY细胞系)明显增强裸鼠皮下成瘤能力,肿瘤生长速率、成瘤重量均明显高于对照组。综上所述,剪接因子PQBP1促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭及体内成瘤能力,发挥癌基因的作用。3.PQBP1通过调控Bcl-x基因的选择性剪接抑制卵巢癌细胞凋亡Annexin/PI双染检测细胞凋亡发现,过表达PQBP1显著抑制卵巢癌细胞凋亡,敲低PQBP1促进卵巢癌细胞凋亡。Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达,发现PQBP1促进Bcl-2的表达,抑制Bax的表达。qPCR检测发现卵巢癌细胞系中敲低PQBP1影响一系列凋亡因子的表达,其中包括Bcl-x。RT-PCR检测PQBP1影响内源性Bcl-x基因的选择性剪接,促进抑凋亡转录本Bcl-xL的表达,抑制促凋亡转录本Bcl-xS的表达。为了进一步验证PQBP1对Bcl-x基因的调控,我们构建了Bcl-x minigene质粒检测PQBP1对外源性Bcl-x基因选择性剪接的影响,发现PQBP1促进Bcl-xL的表达,抑制Bcl-xS的表达。结论1.PQBP1在卵巢癌中显著高表达并与卵巢癌患者预后差相关2.PQBP1促进卵巢癌细胞增殖、侵袭迁移、体内成瘤等恶性行为3.PQBP1调控Bcl-x基因的选择性剪接,促进抑凋亡转录本Bcl-xL的表达,抑制促凋亡转录本Bcl-xS的表达,进而抑制卵巢癌细胞凋亡
【图文】：

量明显高于正常输卵管伞组织（ＰＣ０．０５）（图ＩＢ）。ＴＣＧＡ数据库分析发现逡逑ＰＱＢＰ１在ＨＧＳＯＣ中存在基因扩增和ｍＲＮＡ高表达（１１％），进一步分析发逡逑现ＰＱＢＰ１高表达的患者预后差，ＰＱＢＰ１低表达的患者预后好（图１Ｃ）。综逡逑上所述，ＰＱＢＰ１在高级别浆液性卵巢癌中高表达，，并且和患者预后密切相逡逑关，ＰＱＢＰ１在卵巢癌中出现部分扩增、上调及点突变等遗传改变。以上结逡逑果提示ＰＱＢＰ１可能在卵巢癌的发生和发展过程中发挥重要作用。逡逑Ａ逡逑咖邋１邋ｍｉｍｍｍｉｉｉｉｉｉｉｍｉｉｍｉｍｍｉｍｉｍ＂逡逑＜逡逑Ｇｅｎｅｔｉｃ邋Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ逦｜邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋｜邋Ｄｅｅｐ邋Ｄｅｌｅｔｉｏｎ邋ｍＲＮＡ邋Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋■邋Ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ邋Ｍｕｔａｔｉｏｎ邋■邋Ｍｉｓｓｅｎｓｅ邋Ｍｕｔａｔｉｃ逡逑Ｈｅａｔｍａｐ逡逑Ｂ逦ＰＱＢＰ１逦Ｃ邋ＴＣＧＡ邋ｏｖａｒｉａｎ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｍｉｃｒｏａｒｖａｙ＿ＰＱＢＰ１逡逑＇Ｉ邋寺逡逑办逦今逦逦—１邋？？W逦｜逡逑＼Ｎ逦——邋Ｌｏｗ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（ｂｏｔｔｏｍ邋ＳＣｗ逡逑八令＞逦ｇＪＬ＊、逦—邋Ｈｉｇｈ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（ｔｏｐ邋

抗生素筛选１？２周，构建卵巢癌细胞过表达ＰＱＢＰ１稳转细胞系和敲低ＰＱＢＰ１逡逑稳转细胞系各三种。ｑＰＣＲ验证及Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ＰＱＢＰ１表达水平，逡逑细胞系构建成功（图２Ａａｎｄ２Ｂ）。逡逑Ａ邋￣邋￡？邋，５ｉ逦Ａ２７８０逦￣逦ＨＯ８９１０逦２逦ＳＫＯＶ３逡逑（／）邋Ｏ逦（／）邋Ｏ逦（／｝邋Ｑ逡逑Ｑ）邋Ｑ．逦ｇ邋Ｑ＿逦逦邋０）邋Ｑ．逦＿逡逑ｉｒ°邋■逦ｍ邋劶ｒ邋幽逡逑■Ｚ邋Ｓｉ0－0Ｊ逦逦逦邋0邋ｔｏ＇ｎｊ￣．．．．．－—逦－Ｊ：邋ｔ0．0ｊ＿■■■逦逦逡逑Ｑ：逦ＮＣ邋ｓｈＰＱＢＰＩ逦０＾逦ＮＣ邋ｓｈＰＱＢＰＩ逦江逦ＮＣ邋ｓｈＰＱＢＰＩ逡逑Ａ２７８０逦ＨＯ８９１０逦ＳＫＯＶ３逡逑ＩＮＣ：逦ｓｈＰＱＢＰＩ逦ＮＣ邋ｓｈＰＱＢＰＩ逦ＮＣ邋ｓｈＰＱＢＰＩ逡逑丨丨＿＿＿丨丨丨逦ＰＱＢＰ１逦ｐｑｂｐｉ逦＾ｉｈｈｉｉｐ逦ＰＱＢＰ１逡逑丨⑴丨丨…丨丨＂＿邋：：：：：邋：：—逦Ｔｕｂｕｌｉｎ逦：＿丨．丨丨＂，：丨丨丨邋｜邋＿邋：邋Ｔｕｂｕｌｉｎ逦ｍｍｍｍｍｍｍｍｍ逦Ｔｕｂｕｌｉｎ逡逑ＢＣ逦ＨＥＹ逦ｃ逦ＨＯ８９１０逦ｇ逦ＳＫＯＶ３逡逑．５邋＾３０－，逦．２邋＾２０．逦－２邋￡＊？？．逦．．．逡逑Ｕｑ逦Ｓｏ逦Ｓｑ逡逑ＩＳ＂逦Ｈ逡逑＾邋￡邋卜逡逑§＆１０－逦ｓ逡逑ｘ邋ｏ逦＾邋ａ逦ａ逡逑■３邋ｔ邋Ｏ－ｌ￣￣■逦－ｒ———逦ｆ邋色邋￣￣￣￣￣￣．逦邋ａ；邋￣￣———－ｒ－逦逡逑ＮＣ逦ＰＱＢＰ１逦Ｋ逦ＮＣ逦ＰＱＢＰ１逦＾逦ＮＣ逦ＰＱＢＰ１逡逑ｎｃＨＥｐｑｂｐ，逦１
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.31

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本文编号：2685295