光声导航叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒对卵巢癌的抑制作用研究

发布时间：2020-05-28 10:36

【摘要】：第一部分:叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒的合成及其理化特性的检测目的:制备叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒并检测其理化性质方法:双乳化法合成叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒,观察其光学形态,测量包封率和载药量、粒径及电位分布、光学特性和稳定性等。结果:叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒形态为球形,大小均一,平均粒径为(301.08±11.12)nm,Zeta电位为(-23.40±1.51)mv,吲哚菁绿包封率约(95.67±0.46)%、载药量达(2.79±0.01)%,吸收光谱和荧光光谱未见明显的波长偏移,且荧光稳定性较游离吲哚菁绿溶液显著提高。结论:改良的双乳化法可成功制备叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒,并在卵巢癌的治疗中有望实现诊疗一体化的新模式。第二部分:叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒在体内外的多模态成像作用目的:研究叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒作为造影剂在体内外的多模态成像效果。方法:带孔的琼脂凝胶模块用于体外部分的研究,实验分为三组:(a)PBS对照组(control)、(b)携氧脂质纳米粒组(ONPs)和(c)叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒组(FA-OINPs),其中c组按不同的ICG浓度又分为8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml和64μg/ml。808nm激光以1.5w/cm~2的强度辐照5分钟,百胜超声诊断仪分别采集激光辐照前后的超声图像(B超模式和造影增强模式),Vevo LAZR光声成像系统采集辐照前后的光声成像图,最后运用相应的图像处理软件定量分析结果。体内部分利用SKOV3卵巢癌皮下移植瘤裸鼠模型进行实验,将荷瘤裸鼠随机分为两组:(a)携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒组(OINPs)和(b)叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒组(FA-OINPs),尾静脉注射等浓度(64μg/ml)纳米粒混悬液,利用Vevo LAZR光声成像系统采集不同时间点裸鼠肿瘤处的光声信号,观察纳米粒在肿瘤部位的聚集及代谢情况。另取荷瘤裸鼠随机分为三组:(a)生理盐水组(saline)、(b)携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒组(OINPs)和(c)叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒组(FA-OINPs),尾静脉注射相应的溶液,6h后用808nm激光1.5w/cm~2辐照5分钟,Vevo LAZR光声成像系统采集注射前、辐照前、后的光声图像,定量分析方法同体外。结果:琼脂凝胶模块体外成像:与其余两组相比,FA-OINPs组在激光辐照后的多模态成像效果较辐照前有显著增强(P0.01),且该组不同浓度纳米粒辐照后的B超模式、造影增强模式及光声模式分别符合线性方程y=1.07x+23.51(R~2=0.92),y=0.41x-0.59(R~2=0.99)和y=0.0080x+0.21(R~2=0.93),说明激光辐照后FA-OINPs成像增强效果与纳米粒的浓度成线性相关。荷瘤裸鼠体内成像:FA-OINPs在注射后6h肿瘤部位光声信号最强,而OINPs于注射后12h达峰值,且信号强度弱于FA-OINPs(P0.01),说明FA-OINPs较OINPs能更快更多的聚集到肿瘤部位。激光辐照后,OINPs组PA信号增加16.39%,B超信号增加6.25%,而FA-OINPs组PA信号增加20.32%,B超信号增加13.17%。结论:叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒能作为造影剂进行超声/光声双模态成像,且相较于非靶纳米粒,FA-OINPs能更快更多的聚集到肿瘤部位。同时,在激光辐照后,成像效果显著增强,有助于实现卵巢癌治疗的诊疗一体化新模式。第三部分:光声介导叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒对卵巢癌细胞的靶向杀伤作用研究第一节叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒对卵巢癌细胞体外寻靶能力的研究目的:探讨叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒SKOV3卵巢癌细胞的寻靶能力。方法:取对数生长期的SKOV3细胞随机分为OINPs组、FA-OINPs组和FA-OINPs+游离叶酸阻断组,其中阻断组提前用足量的叶酸封闭细胞受体。A549细胞随机分为OINPs组和FA-OINPs组。对应各组分别给予DiI标记的OINPs或FA-OINPs,共孵育30分钟,激光共聚焦显微镜观察各组荧光信号。结果:SKOV3细胞中,FA-OINPs组荧光信号显著强于OINPs组,表明FA-OINPs能主动靶向到SKOV3细胞并被其吞噬,而叶酸阻断后,荧光信号显著减弱,表明这种主动寻靶能力是由叶酸介导的;同时与叶酸受体低表达的A549细胞相比,FA-OINPs能更多的被叶酸受体高表达的SKOV3细胞吞噬,进一步表明FA-OINPs具有叶酸介导的特异性靶向能力。结论:FA-OINPs能特异性识别叶酸受体高表达的SKOV3细胞,具有优良的寻靶能力。第二节光声激发叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒对卵巢癌细胞的杀伤作用及机制目的:探究光声激发叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒对卵巢癌细胞增殖及凋亡的影响和相关机制方法:用ROS试剂盒检测SKOV3细胞中活性氧的产生情况,实验分为7组:(a)对照组(control)、(b)光声组(L.U.)、(c)游离吲哚菁绿+光声组(ICG+L.U.)、(d)携氧脂质纳米粒+光声组(ONPs+L.U.)、(e)携氧载吲哚菁绿纳米粒+光声组(OINPs+L.U.)、(f)叶酸靶向携氧载吲哚菁绿纳米粒+光声组(FA-OINPs+L.U.)和(g)叶酸靶向携氧载吲哚菁绿纳米粒+光声+乙酰基-L-半胱氨酸组(FA-OINPs+L.U.+LNAC),分别给予相应处理后进行检测。取对数生长期的SKOV3细胞随机分为6组,同上(a)~(f),给予相应的处理,MTT法检测各组细胞的增殖抑制率,流式细胞学Annexin V-FITC/PI双染法检测各组细胞的凋亡情况。结果:除单独光声组外,其余各处理组均有活性氧产量的增加,其中FA-OINPs+L.U.组活性氧的产生量增加最明显,为(179.46±22.46)%,显著高于其余各处理组(P0.01);同时,该组的细胞增殖抑制率和凋亡率分别为(68.94±4.83)%和(75.51±0.88)%,明显高于其余各处理组(P0.01)。结论:光声介导叶酸靶向携氧载吲哚菁绿纳米粒能促进SKOV3卵巢细胞凋亡,抑制细胞增殖,降低其存活率。其机制可能与光声动力介导下FA-OINPs能显著增强细胞内活性氧的产生及纳米粒的空化和机械效应有关。第四部分:叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒协同光声动力对裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的抑制作用研究第一节叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒的光辐热效应目的:探讨激光介导下叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒在体内外的光辐热效应。方法:48孔板用于体外光辐热效应的研究,SKOV3卵巢癌皮下移植瘤裸鼠用于体内研究,实验分为四组:(a)生理盐水(saline)、(b)游离吲哚菁绿组(free ICG)、(c)携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒组(OINPs)和(d)叶酸靶向携氧载吲哚菁绿纳米粒组(FA-OINPs),808nm激光1.5w/cm~2辐照5分钟,红外热成像仪系统记录图片和温度变化。结果:体外光辐热效应发现,808nm激光辐照后,生理盐水组、游离ICG组、OINPs组和FA-OINPs组的最高温度分别为26.8℃、41.3℃、45.6℃和47℃。与生理盐水组相比,其余三组温度均有显著升高,其中OINPs组和FA-OINPs组温度超过43℃,能对肿瘤产生不可逆的损伤,表明激光介导下纳米粒具有光辐热效应。体内红外热成像图显示,生理盐水组、游离ICG组、OINPs组和FA-OINPs组,在激光辐照后,肿瘤部位的最高温度分别为36.4℃、37.1℃、40.1℃和44.8℃,与其余三组相比,FA-OINPs的光辐热效应最显著。结论:激光介导下叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒具有光辐热效应,有望为肿瘤的联合治疗提供新策略。第二节:叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒协同光声动力对裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的抑制作用目的:探讨叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒协同光声动力对裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的抑制作用及其机制。方法:将荷瘤裸鼠随机分为5组:(a)生理盐水组(saline)、(b)游离吲哚菁绿+光声组(ICG+L.U.)、(c)携氧脂质纳米粒+光声组(ONPs+L.U.)、(d)携氧载吲哚菁绿纳米粒+光声组(OINPs+L.U.)和(e)叶酸靶向携氧载吲哚菁绿纳米粒+光声组(FA-OINPs+L.U.),每组8只,治疗结束后第15天,每组随机处死3只裸鼠获取肿瘤和主要脏器,HE染色观察纳米粒的生物安全性,TUNEL检测肿瘤细胞的凋亡指数,VEGF及CD34检测肿瘤微血管变化,CD68标记叶酸受体高表达的肿瘤相关巨噬细胞(TEMs),余下裸鼠继续观察记录生存期。结果:HE染色提示各组主要脏器未见明显的器官损伤;FA-OINPs+L.U.组肿瘤细胞凋亡率为(69.47±4.49)%,明显高于其余各治疗组(P0.05);而在CD68阳性细胞的累积光密度值(IOD)中,FA-OINPs+L.U.组显著低于其余各组(P0.05);VEGF表达率及MVD计数提示,除游离ICG组外,其余各治疗组均低于对照组(P0.05),其中FA-OINPs+L.U.组降低最明显(P0.05)。(a)~(e)组中位生存时间依次为28,29,32,39和50天。结论:叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒协同光声动力能通过主动靶向作用提高纳米粒载药系统对肿瘤细胞的杀伤和抑制作用,延长裸鼠移植瘤模型的中位生存期。其机制可能与肿瘤乏氧微环境改善,活性氧产生增加,光声介导下纳米粒的空化机械效应及光辐热联合作用有关。
【图文】：

形态图,纳米粒,形态图,结构示意图

1.1 纳米粒的结构示意图和大体形态图。（a）为 FA-OINPs 纳米粒结构示意为内核，磷脂双分子层为外壳，ICG 包载于纳米粒中。（b）FA-OINPs 混悬液乳剂。gure1.1(a)SchematicillustrationofthestructureofFA-OINPs,theoxygen-carrre, phospholipid bilayers as the shell, and ICG is encapsulated in the nanopaeral morphology of the FA-OINPs suspension is a green emulsion.

曲线,粒径图,粒径分布,光镜

a）FA-OINPs 的光镜图（X400），（b）粒径分布图，（c）粒径图。 (a) The optical microscope image of FA-OINPs (X400), (b) the sy and (d) the zeta potential of FA-OINPs.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31

【参考文献】