ADAMTS9在无菌性炎症引起的早产中的作用研究

发布时间：2020-05-28 20:58

【摘要】：目的本研究通过自发性早产动物模型以及细胞实验,探索在无菌性炎症环境中,ADAMTS9基因表达与胎盘组织炎症细胞浸润程度及胎膜细胞凋亡的相关性,从而阐述ADAMTS9基因表达与自发性早产的可能联系。方法动物模型构建(1)妊娠模型:8周龄C57BL/6小鼠,体重为19~21克,雌性36只随机分为3组,12只/组,雄性12只随机分为3组,4只/组;雌雄合笼,雌鼠出现阴道栓记为孕1天,3天后雌雄分离并将无阴道栓出现的雌鼠剔除。(2)无菌性炎症模型:孕10天起,3组雌鼠均腹腔注射白介素-6(IL-6),1次/2日;(3)慢病毒感染模型:ADAMTS9慢病毒敲降体系购自吉凯生物(上海,中国),包括慢病毒及对照用空载体,选用磷酸盐缓冲液(1×PBS)作为空白对照,在雌鼠孕1天、10天分别进行尾静脉注射,处理后3组小鼠分别为PBS空白对照组,空载体对照组及慢病毒敲降组。(4)早产模型:以小鼠出现阴道流血(阴道口有血渍)作为早产启动的判定标准(Romero),小鼠出现早产征象当天断颈处死,未出现则于孕19天处死;处死后取小鼠胎盘组织分为两份,一份进行QRT-PCR检测ADAMTS9 mRNA含量以验证基因敲降的效果,一份石蜡包埋行HE染色观察炎细胞浸润情况,并通过免疫组化测ADAMTS9、TNF-α、IL-6蛋白表达情况。细胞实验无菌性炎症时体内可能受累的靶细胞为胎膜细胞,因此选取人胎膜细胞系—WISH细胞系,进行ADAMTS9慢病毒敲降体系转染。处理后将细胞系分为敲降组、空白对照组以及空载体对照组,加入IL-6模拟炎症环境培养24小时后,首先利用QRT-PCR及Western blot验证慢病毒敲降ADAMTS9基因的效率并测定Caspase-3 mRNA及蛋白表达量,最后流式分析检测三组细胞的凋亡率并进行比较。结果动物实验:(1)敲降小鼠体内ADAMTS9基因后,小鼠早产率显著降低(各组早产率:空白对照组90%,空载体对照组70%,敲降组22.2%)。(2)与空白对照组及空载体对照组相比,敲降组小鼠胎盘组织中ADAMTS9 mRNA水平及蛋白表达量降低并有统计学意义(p0.05)。(3)三组小鼠胎盘组织中TNF-α、IL-6的表达均增加,说明无菌性炎症形成。与空白对照组及空载体对照组相比,敲降组小鼠胎盘组织中ADAMTS9蛋白表达显著降低。细胞实验:(1)与空白对照组及空载体对照组相比,敲降组中ADAMTS9 mRNA水平及蛋白表达量显著低于空白对照组及空载体对照组,说明慢病毒敲降体系显著抑制了ADAMTS9基因表达。(2)敲降组细胞凋亡率(21.2%)显著低于空白对照组(50.1%)及空载体对照组(52.9%),同时,并且敲降组WISH细胞中细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达显著低于空白对照组及空载体对照组。结论无菌性炎症条件下,抑制ADAMTS9基因表达可以降低妊娠小鼠早产率,其可能的作用机制为通过抑制胎膜细胞中ADAMTS9基因的表达,降低胎膜细胞凋亡率,从而抑制早产临产。因此未来有可能通过干预措施降低ADAMTS9表达从而降低早产的发生。
【图文】：

小鼠,对照组,无菌性炎症,阴道栓

降妊娠小鼠 ADAMTS9 基因可以显著降低由无菌性炎症引起的早产的过阴道栓判断小鼠妊娠，发现空白对照组、空载体对照组、敲降组各0、9 只小鼠成功受孕。三组小鼠分别尾静脉注射 PBS、慢病毒空载体。孕中期（孕 10 天）开始每天腹腔注射 IL-6（2×104U/kg），观察小局。小鼠妊娠周期为 19~21 天，，继续饲养至孕 18 天，发现空白对照组阴道口有血渍，为小鼠发生早产的征象，于小鼠孕 19 天断颈法处死小剖结果，如图 1。故空白对照组，空载体对照组，敲降组小鼠的早产 90%、70%、22.2%，说明敲降小鼠体内 ADAMTS9 基因后，当小鼠无菌性炎症时，小鼠早产率显著降低。妊娠数阴道流血数胚胎发育数早产率对照组 10 1 2 90%对照组 10 0 3 70%降组 9 0 7 22.2%

小鼠胎盘,石蜡切片,无菌性炎症,小鼠模型

利用ABI 7500 Fast 进行 QRT-PCR 检测 ADAMTS9 含量以验证基因敲降的效果（图2），敲降组小鼠胎盘组织中 ADAMTS9 mRNA 表达量显著小于空白对照组及空载体对照组（p＜0.05）。另一份制备石蜡切片，将三组石蜡切片行免疫组化测ADAMTS9 的表达量，在 10×10 倍镜下观察（图 3），敲降组 ADAMTS9 的蛋白表达量显著低于对照组。同理，测得三组胎盘组织中 TNF-α、IL-6 在 mRNA 水平及蛋白水平表达量均增加（图 4-5），说明敲降 ADAMTS9 基因的小鼠模型构建成功，且小鼠胎盘组织中形成无菌性炎症。图 2 三组小?
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.21

【参考文献】