PRMT5在子宫内膜癌中的作用及机制研究
发布时间：2020-06-06 05:33
【摘要】：[研究目的]子宫内膜癌(endometrial cancer)是仅次于宫颈癌的第二大女性生殖系统肿瘤,有逐年增高和年轻化的趋势。蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)是一种新兴的表观遗传学酶,主要通过对组蛋白精氨酸残基H4R3,H3R8和H2AR3的双甲基化,调控靶基因的转录。本课题主要研究蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)在I型子宫内膜癌恶性进展中的生物学作用及其作用机制,探讨其表达与疾病进展和不良预后的关系,为子宫内膜癌寻找新的诊断标志物及治疗靶点。[实验方法]1、研究病例标本的选择选取山东大学齐鲁医院病理科存档的病例及蜡块,包括子宫内膜样腺癌、子宫内膜粘液腺癌、非典型增生和简单/复杂增生子宫内膜组织,并完善相关临床病理资料。选取病例的所有切片都进行重新的阅片和判读。2、免疫组化及相关性分析通过免疫组化技术检测PRMT5的表达在不同类型子宫内膜癌组织和增生内膜组织中有无区别,分析PRMT5的表达与EC临床病理特点(年龄、组织学级别、淋巴结转移等)之间的相关性,以及PRMT5表达与ERα表达的相关性。3、两种细胞株中PRMT5的表达运用免疫组织化学、WestemBlot和rt-qPCR技术,从蛋白水平及mRNA水平比较高分化Ishikawa和中分化KLE两种子宫内膜癌细胞系中PRMT5的表达差异。4、细胞培养及转染设计合成PRMT5 shRNA对ERαp阳性子宫内膜癌细胞系Ishikawa进行转染,用RT-PCR和Western blot检测PRMT5蛋白表达情况。评价转染效率。5、检验沉默PRMT5基因后子宫内膜癌细胞功能的变化①细胞增殖检测:CCK-8法检测shRNA干扰PRMT5的表达后对肿瘤细胞增殖能力的影响;②克隆/集落形成实验:检测PRMT5基因沉默后,肿瘤细胞空间克隆/集落形成能力的变化;③ 细胞侵袭、迁移能力分析:利用细胞划痕实验、Transwell实验检测PRMT5基因沉默后肿瘤细胞侵袭、迁移能力的变化;④细胞凋亡检测:shRNA干扰PRMT5后,用AnnexinV-FITC凋亡试剂盒染色,流式细胞仪上检测肿瘤细胞凋亡的变化;⑤细胞周期检测:shRNA干扰PRMT5后,用贝博周期试剂盒染色,流式细胞仪检测对肿瘤细胞周期的影响。⑥运用Western Blot和rt-qPCR技术寻找PRMT5的表达与增殖、凋亡相关的蛋白之间的相互作用6、探索沉默PRMT5对雌激素受体ERα表达的影响及机制利用shRNA敲低Ishikawa细胞系的PRMT5,与NC组相比,观察雌激素受体ERα的表达变化,预测PRMT5的下游靶基因,并利用Western blot实验进行验证。7、检验PRMT5与SRC-1及雌激素受体ERα的结合运用co-ip实验验证PRMT5与甾体激素受体辅助激活蛋白-1(SRC-1)、雌激素受体ERα的结合作用。8、探索E2对PRMT5的影响通过细胞系饥饿、梯度雌激素E2加药培养实验观察E2对PRMT5表达是否有影响。[结论]1、PRMT5在子宫内膜样腺癌组织中高表达,着色以细胞浆为主,而在子宫内膜粘液腺癌中低表达或失表达。在简单增生、复杂增生、非典型增生、子宫内膜样腺癌阳性率依次升高,分别为39%、77%、90%和95%(P0.001,其差异具有统计学意义)。其表达与肿瘤的分化程度相关,在高、中分化子宫内膜癌中表达较高,在低分化子宫内膜癌中失表达;此外,PRMT5还与子宫内膜样腺癌的Ki-67增殖指数以及淋巴结转移、ERα的表达有统计学关联。2、沉默子宫内膜癌细胞中的PRMT5基因,其增殖及克隆能力明显降低、凋亡增多。肿瘤细胞迁移及侵袭能力明显下降,表明PRMT5可以调控肿瘤的增殖和凋亡,从而影响其发生和发展。PRMT5可以通过上调c-Myc促进细胞的增殖,上调Bcl-2,下调P53的表达水平对细胞凋亡起到抑制的作用。因此,针对PRMT5开发基因治疗的药物,有可能成为子宫内膜癌抑制治疗的新靶点。3、通过信号通路各蛋白表达的分析,在Ishikawa细胞系中沉默PRMT5的表达后,雌激素受体ERα表达量受抑制,PRMT5的对肿瘤细胞的增殖和调控可能是通过对雌激素受体ERα的调节实现的,且PRMT5与甾体激素受体辅助激活蛋白-1(SRC-1)、雌激素受体ERca能形成复合物。4、通过梯度激素加药实验发现E2能抑制PRMT5表达。
【图文】：
１．邋ＰＲＭＴ５在子宫内膜样腺癌中的表达明显升高逡逑免疫组织化学结果显示，ＰＲＭＴ５在子宫内膜样腺癌（ＥＥＣ）中表达阳性率最逡逑高，，而在Ｉ型子宫内膜癌亚型ＭＥＣ邋（子宫内膜癌粘液腺癌）中失表达。在２１例逡逑子宫内膜粘液腺癌中，粘液部分表现为低表达或阴性，仅对于粘液腺癌伴部分子逡逑宫内膜样腺癌分化的混合病例中，子宫内膜样腺癌分化的部分有胞浆ＰＲＭＴ５高逡逑表达。ＰＲＭＴ５在３３例单纯增生、２２例复杂X椛ⅲ保崩堑湫驮錾ⅲ矗怖庸阱义夏ぱ侔┲械难粜月室来紊撸直鹞常梗ュ澹ǎ保常常常ⅲ罚罚ィǎ保罚玻玻ⅲ梗埃ィǎ保埃保保╁义虾停梗担ィǎ矗埃矗玻╁澹ǎ校迹埃埃埃保钜炀哂型臣蒲б庖澹＃校遥停裕底橹旧嵌ㄎ唬海矗插义侠庸谀ぱ侔┲校常崩氏职校遥停裕蹈弑泶铮估氏郑校遥停裕档牡捅泶铮义希怖跣员泶铩Ｔ谧庸谀じ丛釉錾保埃玻驳难粜圆±斜硐治桶斯餐义媳泶铩＃常忱庸谀さゴ啃栽錾±南偬逯杏校独拾吮泶铮防∪隋义舷偬宀槐泶铮渲氏赴拾吮泶铮偾逋技铰迹怠ⅲ丁ⅲ贰ⅲ浮ⅲ埂ⅲ保啊ⅲ保保ｅ义
本文编号：2699235
【图文】：
１．邋ＰＲＭＴ５在子宫内膜样腺癌中的表达明显升高逡逑免疫组织化学结果显示，ＰＲＭＴ５在子宫内膜样腺癌（ＥＥＣ）中表达阳性率最逡逑高，，而在Ｉ型子宫内膜癌亚型ＭＥＣ邋（子宫内膜癌粘液腺癌）中失表达。在２１例逡逑子宫内膜粘液腺癌中，粘液部分表现为低表达或阴性，仅对于粘液腺癌伴部分子逡逑宫内膜样腺癌分化的混合病例中，子宫内膜样腺癌分化的部分有胞浆ＰＲＭＴ５高逡逑表达。ＰＲＭＴ５在３３例单纯增生、２２例复杂X椛ⅲ保崩堑湫驮錾ⅲ矗怖庸阱义夏ぱ侔┲械难粜月室来紊撸直鹞常梗ュ澹ǎ保常常常ⅲ罚罚ィǎ保罚玻玻ⅲ梗埃ィǎ保埃保保╁义虾停梗担ィǎ矗埃矗玻╁澹ǎ校迹埃埃埃保钜炀哂型臣蒲б庖澹＃校遥停裕底橹旧嵌ㄎ唬海矗插义侠庸谀ぱ侔┲校常崩氏职校遥停裕蹈弑泶铮估氏郑校遥停裕档牡捅泶铮义希怖跣员泶铩Ｔ谧庸谀じ丛釉錾保埃玻驳难粜圆±斜硐治桶斯餐义媳泶铩＃常忱庸谀さゴ啃栽錾±南偬逯杏校独拾吮泶铮防∪隋义舷偬宀槐泶铮渲氏赴拾吮泶铮偾逋技铰迹怠ⅲ丁ⅲ贰ⅲ浮ⅲ埂ⅲ保啊ⅲ保保ｅ义
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