BRCA1调节自噬和凋亡促进卵巢癌干细胞顺铂耐药的机制研究

发布时间：2020-06-06 20:13

【摘要】：目的:在妇科恶性肿瘤中,卵巢癌(ovarian cancer,OC)的发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌,而死亡率位居首位。因卵巢解剖部位隐蔽,早期缺乏典型的临床症状和可靠的检测方法,多数患者在发现及诊断出卵巢癌时已处于疾病晚期。目前针对卵巢癌的有效靶向治疗仍然是妇科临床医师亟需思考的问题,其耐药机制的研究也一直是近几年来的研究重点。本研究主要探讨乳腺癌1号基因(breast cancer 1,BRCA1)、自噬与卵巢癌顺铂耐药之间的关系,化疗耐药的上皮源性卵巢癌干细胞(epithelial ovarian cancer stem cells,EOCSCs)中自噬相关基因及蛋白表达的改变及调节BRCA1表达后自噬水平及耐药性变化的机理,进而丰富卵巢癌病因学理论,为卵巢癌这种发病率高、恶性程度高、死亡例数高的妇科肿瘤的治疗提供新思路。研究方法:1、利用Realtime PCR方法和Western Blot方法检测BRCA1在人卵巢癌化疗敏感组织标本和化疗耐药组织标本中的表达,并结合组织样本信息进行临床病理学参数分析。利用Realtime PCR方法检测卵巢癌组织中自噬及耐药相关基因的表达;利用Western Blot法检测卵巢癌组织中自噬调节蛋白、自噬标记蛋白以及干细胞标记蛋白的表达;分析卵巢癌组织样本中BRCA1和耐药相关基因表达的相关性。2、培养人卵巢癌细胞系SKOV3,采用无血清悬浮球方法富集SKOV3-EOCSCs。利用流式细胞术检测EOCSCs表面干细胞标记物的表达;利用Realtime PCR方法检测EOCSCs中细胞干性及耐药相关基因的表达;利用Western Blot方法检测EOCSCs中干细胞标记蛋白的表达;通过CCK-8法和EdU实验检测EOCSCs的细胞活力和增殖活性;利用Realtime PCR和Western Blot方法检测EOCSCs中BRCA1的表达;利用Western Blot方法检测耐药相关蛋白的表达和LC3-II/I比值;通过mRFP-GFP-LC3双标腺病毒转染的方法检测自噬流强度。3、构建BRCA1过表达载体,转染到EOCSCs中并通过Western Blot方法对转染效率进行验证。利用Western Blot方法检测自噬调节蛋白、自噬标记蛋白耐药相关蛋白以及干细胞标记蛋白的表达;通过mRFP-GFP-LC3双标腺病毒转染的方法检测自噬流强度;利用流式细胞术检测细胞在顺铂处理后的凋亡水平。将BRCA1过表达质粒转染到贴壁的人卵巢癌细胞系SKOV3中,并利用流式细胞术检测细胞表面干细胞标记物的表达。构建si-BECN1、si-ATG5,敲低自噬调节基因,将各组siRNA分别转染至EOCSCs中,并通过Realtime PCR和Western Blot的方法对转染效率进行验证。利用流式细胞术检测各组细胞在顺铂处理后的凋亡水平。4、构建BRCA1表达敲低慢病毒载体,将慢病毒转染至EOCSCs中,通过Western Blot方法验证转染效率并通过荧光显微镜观察转染情况。自噬激活实验:2.5μM Torkinib(PP242)作用24 h,100nM Rapamycin作用36h,激活自噬后开始顺铂干预;自噬抑制实验:100μM Chloroquine作用48 h,100mM 3-methyladenosine作用24 h,抑制自噬后开始顺铂干预。在BRCA1不同表达水平的EOCSCs中调节自噬活性,通过CCK-8法检测各组细胞的细胞活力和增殖活性;利用流式细胞术检测各组细胞的细胞周期。最后利用Western Blot方法检测各组EOCSCs中BRCA1、自噬调节蛋白、干细胞标记蛋白和耐药相关蛋白的表达变化以及LC3-II/I比值变化。结果:1、BRCA1在人卵巢癌化疗耐药组织中表达显著上调;BECN1、ATG5、ATG7、ABCG2、ABCB1的mRNA水平在化疗耐药卵巢癌组织中明显高于化疗敏感卵巢癌组织,Beclin-1、ATG5、POU5F1、NANOG的蛋白表达水平在化疗耐药卵巢癌组织中明显高于化疗敏感卵巢癌组织,LC3-II/I比值明显增高,ATG7表达增高不显著,p62表达水平变化无统计学意义;卵巢癌组织中BRCA1与ABCG2基因表达水平存在正相关。2、通过无血清悬浮球方法能够从人卵巢癌细胞系SKOV3中分离和富集EOCSCs,且与SKOV3细胞系相比EOCSCs拥有更强的细胞活力和增殖能力,高表达的干细胞相关因子CD44、CD133、POU5F1、NANOG,高表达的耐药相关蛋白P-gp、ABCG2和更强的耐药性,以及高表达的BRCA1和更高的自噬通量。3、以EOCSCs为工具细胞,过表达BRCA1显著促进了自噬的发生和发展,ATG5、Beclin-1蛋白水平明显增高,ATG7变化不显著,自噬流明显增强;过表达BRCA1能够上调耐药相关蛋白P-gp、ABCG2的表达,对TP53-BP1的调节作用不明显;随着BRCA1表达和自噬水平的增高,干细胞相关标记蛋白POU5F1和NANOG的表达明显增高。在贴壁的SKOV3细胞中上调BRCA1后,干细胞相关表面标记物CD44的表达有明显增高。在顺铂作用下,过表达BRCA1能够抑制EOCSCs的凋亡,敲低自噬调节基因BECN1和自噬相关基因ATG5能够促进凋亡。4、沉默BRCA1显著降低了EOCSCs的细胞活力,细胞周期出现G2/M期阻滞;激活自噬后细胞活力出现明显增加,G2/M期阻滞程度有所缓解;抑制自噬活性后,细胞活力出现明显减弱,G2/M期阻滞程度增加,出现明显凋亡峰。沉默BRCA1通过负性调节Beclin-1表达,抑制LC3-I向LC3-II转化,阻碍自噬发生发展进程,进而抑制P-gp表达,降低EOCSCs耐药性,同时对卵巢癌细胞的干细胞特性转化起到负向调节作用;激活自噬后BRCA1表达降低。结论:1、BRCA1在化疗耐药的卵巢癌组织和EOCSCs中表达,BRCA1呈高表达,且化疗耐药的卵巢癌组织具有较高水平的基础自噬。2、利用无血清悬浮球方法从人卵巢癌细胞系SKOV3中分离并富集EOCSCs,能够表达多能干细胞表面标记CD44、CD133和干细胞相关因子POU5F1、NANOG,且EOCSCs与亲本细胞相比具有较高的细胞活力和增殖能力,较高的自噬水平及耐药能力。3、BRCA1可以通过正向调节自噬的发生发展,增强EOCSCs的细胞活力和促进增殖、抑制细胞凋亡、缓解细胞周期G2/M期阻滞、增强耐药性以及促进干细胞特性转化。激活自噬能够一定程度上降低BRCA1表达,两者存在相互调节作用。
【图文】：

耐药,卵巢癌组织,分布点,耐药相关基因

中国医科大学博士学位论文.3 耐药相关基因 ABCG2、ABCB1 在卵巢癌化疗耐药组织和敏感组的差异性表达为了验证卵巢癌样本的耐药性，在铂类耐受和铂类敏感性卵巢癌组织中通ealtime PCR 方法检测 ABCG2 和 ABCB1 的 mRNA 水平。结果显示，在耐药组 ABCG2 和 ABCB1 的 mRNA 水平均高于敏感组织（图 1.2）。

散点图,卵巢癌组织,浆液性,相关性研究

图 1.3 BRCA1 与 ABCG2、ABCB1 在卵巢癌组织中的相关性研究A：浆液性卵巢癌组织中 ABCG2 水平与 BRCA1 水平的相关性；B：浆液性卵巢癌组织中ABCB1 水平与 BRCA1 水平的相关性。N=20。散点图中的每个点代表一个独立样本的相对表达。3.5 自噬相关因子在卵巢癌化疗耐药组织和敏感组织中的差异性表达Realtime PCR 结果显示 BECN1，ATG5 和 ATG7 的 mRNA 水平在耐药组织中高于敏感组织（图 1.4 A,E,G）。Western Blot 结果显示 Beclin-1，，ATG5 和 LC3II/I 在耐药组织中的表达显着高于敏感组织（图 1.4 B,F,D）。ATG7 的表达略有增加趋势，自噬底物 p62 表达有下降的趋势（图 1.4 H,C），差异无统计学意义。这些结果表明 BRCA1 和自噬可能参与卵巢癌耐药的发展和维持。3.6 干细胞相关因子 POU5F1 和 NANOG 在卵巢癌化疗耐药组织和敏
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.31

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