BMSCs在窦前卵泡体外培养中的作用研究及3D培养体系的构建

发布时间：2020-06-07 00:22

【摘要】：第一部分BMSCs在窦前卵泡体外培养中的作用研究【目的】观察BMSCs在窦前卵泡体外培养中的作用。【方法】获取2周龄小鼠窦前卵泡,和BMSCs在transwell小室内体外共培养为BMSCs共培养组,相同条件下未处理的小鼠窦前卵泡为体外单独培养组,体内获取的成熟卵母细胞为体内对照组。观察窦前卵泡生长速度、卵母细胞成熟率,通过免疫荧光检测MⅡ期纺锤体异常率,化学发光免疫分析法检测培养上清中雌激素浓度。【结果】BMSCs共培养对窦前卵泡体外培养发育速度无明显影响,BMSCs共培养后窦前卵泡存活率并没有明显变化,共培养组窦腔形成率(49.22%)高于单独培养组(29.47%)(P0.05),共培养组卵母细胞成熟率(31.75%)高于单独培养组(16.84%)(P0.05)。免疫荧光结果显示体外单独培养组卵母细胞锤体形态发生明显异常,微管排列紊乱;共培养组及体内对照组纺锤体形态完整,微管排列整齐。体外共培养组卵母细胞纺锤体异常率(34.78%)显著低于体外单独培养组(52.17%)(P0.05),但仍然高于体内成熟组(25.53%)(P0.05)。培养第四天开始,共培养组培养液中雌激素明显高于体外单独培养组(P0.05)。【结论】BMSCs共培养后窦前卵泡的窦腔形成率及卵母细胞成熟率升高,纺锤异常率下降,培养基中雌激素分泌增加,说明了BMSCs共培养可以提高窦前卵泡体外培养的质量以及颗粒细胞的分泌功能。第二部分3D培养体系构建及安全性检测【目的】构建最佳3D培养体系,明确其安全性。【方法】构建四种3D培养体系:胶原蛋白体系、藻酸盐体系、胶原蛋白+DNA水凝胶体系、藻酸盐+DNA水凝胶体系,同时以2D培养体系作为对照。将五种体系分别与窦前卵泡共培养,观察卵泡的生长发育情况;将五种体系分别与GCs与BMSCs共培养72h,采用Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒检测各组颗粒细胞及BMSCs凋亡情况,Western blot分别检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达情况。【结果】四种3D培养体系构建成功,窦前卵泡在四种3D培养体系中均可以存活生长发育,其中藻酸盐+DNA水凝胶组卵泡发育速度最快,颗粒细胞层数最多;GCs和BMSCs在四种培养体系中均生长良好,凋亡流式检测显示各组凋亡指数均小于1%,凋亡相关蛋白的表达水平在各组间无显著性差异(P0.05)。【结论】四种3D培养体系对GCs和BMSCs的增殖无影响;鉴于窦前卵泡在藻酸盐+DNA水凝胶体系中发育最好,初步确定藻酸盐+DNA水凝胶培养体系为最优体系。
【图文】：

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 SCs 的培养种的细胞种类较多，大部分细胞呈圆形，悬浮于培养液中，其中种 24h 后部分细胞贴附于瓶底，部分细胞仍悬浮在培养液中。经贴壁生长，细胞小而且形态多样。培养 2 周左右，细胞融合成可进行细胞的首次传代。传代后，细胞生长速度增快。传 3-4 代的长梭形。（图 1-1）

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文图 1-2 BMSCs（P4）的流式鉴定图2 BMSCs 诱导分化BMSCs 成骨诱导 21 天，细胞内可见结节，经茜素红染色后可见红色诱导 21 天，细胞内产生脂滴，经油红 O 染色，，可见红色脂滴。说明MSCs 具有多功能干性，可用于后续实验（图 1-3）。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714.8

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本文编号：2700513