外源性Collagen I诱导下TM4SF1及DDR1对卵巢癌细胞迁移及侵袭的研究

发布时间：2020-06-10 17:35

【摘要】：第一部分盘状结构域受体1在卵巢癌组织中的表达及临床意义目的探讨人卵巢癌组织中盘状结构域受体1(DDR1)蛋白的表达情况及其临床意义。方法运用免疫组化法检测33例正常卵巢组织、43例卵巢良性肿瘤组织及94例卵巢癌组织中的DDR1蛋白表达情况,比较不同临床病理特征卵巢癌病人的DDR1蛋白阳性表达率,分析DDR1蛋白阳性表达与卵巢癌病人病理特征及预后的关系。结果卵巢癌组织的阳性表达率[55.32%(52/94)]均高于正常卵巢组织[0(0/33)]、卵巢良性肿瘤组织[11.63%(5/43)](均P0.05),而正常卵巢组织与良性卵巢肿瘤组织的阳性表达率比较,差异无统计学意义(P0.05)。FIGOⅢ~Ⅳ期、低分化、有腹腔转移病人的DDR1蛋白的表达阳性率[60.98%(50/82)、62.16%(46/74)、66.67%(42/63)]分别高于FIGOⅠ~Ⅱ期、中-高分化者、无腹腔转移的病人的阳性表达率[16.67%(2/12)、30%(6/20)、32.26(10/31)](均P0.05)。卵巢癌组织中DDR1蛋白的阳性表达及腹腔转移是卵巢癌患者死亡的危险因素(P0.05)。结论DDR1蛋白在卵巢癌组织中呈高表达,其可能参与了卵巢癌的发生发展与远处转移,或可成为评估患者预后的重要因素。第二部分外源性Collagen I诱导下TM4SF1对高转移性卵巢癌细胞HO8910PM生物学行为影响的体外研究目的研究外源性Collagen I诱导下TM4SF1对高转移性卵巢癌细胞H O8910PM的体外生物学行为的影响。方法慢病毒转染RNAi抑制TM4SF1在HO8910PM的表达,RT-PCR以及Western Blot技术检测RNAi后细胞中TM4SF1基因蛋白的表达情况。细胞免疫荧光方法检测在有无外源性Collagen I的存在下TM4SF1与DDR1在HO8910PM中的定位,Transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移与侵袭能力的改变。结果成功构建了靶向沉默TM4SF1并同时表达GFP荧光的慢病毒载体,感染并筛选出稳定表达细胞株LV-TM4SF1-RNAi-GFP-HO8910PM以及阴性对照LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM。RT-PCR实验表明TM4SF1基因在m RNA水平沉默效率约为65%,Western Blot检测TM4SF1蛋白沉默效率约为70%。免疫荧光结果显示TM4SF1及DDR1均为细胞膜蛋白,当有外源性Collagen I存在时,TM4SF1可使DDR1在细胞膜上聚集,同时伴随TM4SF1聚集。Transwell迁移实验表明:LV-RNAi-TM4SF1-GFP-H O8910PM组细胞穿过Transwell小室的细胞数为94.667±9.018,较HO8910PM组(257.667±17.898)及LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM组(261.667±29.023)明显下降(P0.05);LV-RNAi-TM4SF1-GFP-HO8910PM在有50μg/ml Collagen I存在的条件下,细胞穿过Transwell小室的细胞数为150.667±7.371,与HO8910PM+50μg/ml Collagen I组(370.000±16.523)及LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM+50μg/ml Collagen I组(377.333±15.948)相比较明显下降(均P0.05)。当有外源性Collagen I存在时,HO8910PM、LV-RNAi-TM4SF1-GFP-HO8910PM、LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM细胞穿过Transwell小室的细胞数均较无外源性Collagen I存在时明显增加(均P0.05)。Transwell侵袭实验表明:LV-RNAi-TM4SF1-GFP-HO8910PM组细胞穿过铺设Matrigel的Transwell小室的细胞数为57.00±5.568,较HO8910PM组(134.333±6.658)及LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM组(141.333±7.638)明显下降(均P0.05),LV-RNAi-TM4SF1-GFP-HO8910PM在有外源性Collagen I存在的条件下,细胞穿过铺设Matrigel的Tr answell小室的细胞数为109.000±4.359,与HO8910PM+50μg/ml Collagen I组(216.333±16.921)及LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM+50μg/ml Co llagen I组(226.667±4.509)相比较明显下降(均P0.05)。当有外源性C ollagen I存在时,HO8910PM、LV-RNAi-TM4SF1-GFP-HO8910PM、LV-C ON-TM4SF1-GFP-HO8910PM细胞穿过铺设Matrigel的Transwell小室的细胞数均较无外源性Collagen I存在时明显增加(均P0.05)。结论TM4SF1与DDR1均为细胞膜蛋白,TM4SF1可以在外源性Collagen I存在的条件下使DDR1在细胞膜上聚集,同时伴随TM4SF1聚集。下调TM4SF1的表达可以抑制卵巢癌HO8910PM细胞的迁移以及侵袭能力。外源性Collagen I的存在可以促进卵巢癌HO8910PM细胞的迁移以及侵袭。第三部分外源性Collagen I诱导下DDR1对高转移性卵巢癌细胞HO8910PM生物学行为影响的体外研究目的研究外源性Collagen I诱导下DDR1对高转移性卵巢癌细胞HO8910PM的体外生物学行为的影响。方法慢病毒转染RNAi抑制DDR1在HO8910PM的表达,RT-PCR以及Western Blot检测干扰效率,Transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移与侵袭能力的改变。结果RT-PCR与Western结果显示,LV-DDR1-RNAi-mcherry-2沉默D DR1效果最佳,RT-PCR实验表明DDR1基因在m RNA水平沉默效率约为85%,Western Blot检测DDR1蛋白沉默效率约为95%。用其感染并筛选出稳定转染细胞株LV-DDR1-RNAi-mcherry-HO8910PM以及阴性对照LV-CO N-DDR1-mcherry-HO8910PM。Transwell迁移实验表明:LV-RNAi-DDR1-mcherry-HO8910PM组细胞穿过Transwell小室的细胞数为99.000±5.292,较HO8910PM组(160.333±6.028)及LV-CON-DDR1-mcherry-HO8910PM组(161.000±4.583)明显下降(均P0.05),LV-DDR1-RNAi-mcherry-HO8910PM在有50μg/ml Collagen I存在的条件下,细胞穿过Transwell小室的细胞数为150.667±5.508,与HO8910PM+50μg/ml Collagen I组(239.000±10.583)及LV-CON-DDR1-mcherry-HO8910PM+50μg/ml Collagen I组(237.667±8.386)相比较明显下降(均P0.05)。Transwell侵袭实验结果显示:LV-RNAi-DDR1-mcherry-HO8910PM组细胞穿过铺设Matrigel的Tra nswell小室的细胞数为66.000±6.557,较HO8910PM组(126.667±6.506)及LV-CON-DDR1-mcherry-HO8910PM组(133.667±7.572)明显下降(均P0.05)LV-RNAi-DDR1-mcherry-HO8910PM在有50μg/ml Collagen I存在的条件下,穿过铺设Matrigel的Transwell小室的细胞数为117.000±7.211,与HO8910PM+50μg/ml Collagen I组(180.000±2.646)及LV-CON-DDR1-mcherry-HO8910PM+50μg/ml Collagen I组(190.000±9.849)相比较明显下降(均P0.05)。当有外源性Collagen I存在时,HO8910PM、LV-RNAi-DDR1-mcherry-HO8910PM、LV-CON-DDR1-mcherry-HO8910PM细胞穿过铺设Matrigel的Transwell小室的细胞数均较无外源性Collagen I存在时明显增加(均P0.05)。结论下调DDR1的表达可以抑制卵巢癌HO8910PM细胞的迁移以及侵袭能力。外源性Collagen I的存在可以促进卵巢癌HO8910PM细胞的迁移以及侵袭。
【图文】：

DDR1 蛋白在正常卵巢上皮细胞未见表达，部分区域见有极浅黄色着色区域，，按 IRS 评分标准为阴性；DDR1 蛋白在良性卵巢肿瘤细胞中的表达主要集中在细胞膜上，细胞质也可看见浅棕黄色着色；而 DDR1 蛋白在卵巢癌细胞中则细胞膜及胞浆中均可见着色颗粒分布。见图 1-1。DDR1 蛋白在正常卵巢癌组织、良性卵巢肿瘤组织及卵巢癌组织中的阳性表达率分别为 0、11.63%（5/43）、55.32%（52/94），差异有统计学意义（χ2=45.926，P<0.001），其中卵巢癌组织的阳性表达率均高于其他组织(均 P<0.05)，而正常卵巢癌组织与良性卵巢肿瘤组织的阳性表达率比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表 1-1。AB CA

图 2-1：荧光显微镜下不同浓度的慢病毒感染 HO8910PM 的感染效率（200×）Fig 2-1 Infection efficiency under microscope after different Virus concentration gradient（200×）2.1.2 慢病毒感染 HO891OPM 的正式实验将 LV-TM4SF1-RNAi-GFP 以及 LV- TM4SF1-CON-GFP 按 MOI=20 感染HO8910PM，72 小时后观察转染效率，感染效率达到 90%以上，见图 2-2。LV-TM4SF1-RNAi-GFP-HO8910PM LV-TM4SF1-CON-GFP-HO8910PMLight GFP Light GFP
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31

【参考文献】

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本文编号：2706622