MiR-34a通过调控HDAC1抑制卵巢癌细胞增殖和顺铂耐药性机制的实验研究

发布时间：2020-06-11 16:26

【摘要】：研究背景上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)作为女性生殖系统常见三大恶性肿瘤之一,其致死高率居三者之首。75%的患者诊断时已为晚期,EOC患者的 5年生存率徘徊于40%左右,2年内复发率超过60%。癌细胞对化疗药物所致的获得性耐药是治疗失败的重要原因,细胞增殖及化疗耐药是EOC治疗面临的最大的挑战。MiR-34a 属于 miR-34ac/34bc-5p/449abc/449c-5p 家族,位于染色体lp36位点,在细胞增殖凋亡稳态失衡时起到重要作用。文献报道miR-34a在肿瘤细胞中起到“抑癌基因”的作用,能够抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及耐药等多种恶行生物学行为。乙酰化和去乙酰化是组蛋白翻译后修饰的重要组成部分,组蛋白乙酰化的不平衡可能导致染色质结构的变化并进一步影响细胞周期进展,分化和/或凋亡的基因转录失调。与正常发育所需的许多基因一样,HDAC的失调功能可导致癌症。因此,在许多癌症中观察到HDAC的过表达。在肿瘤细胞通常发现HDAC同工酶的高水平表达和相应的组蛋白的低乙酰化状态。卵巢癌细胞增殖及耐药过程中miR-34a及HDAC1所起到的调控作用未见报道。本课题通过RT-qPCR方法检测miR-34a及HDAC1在卵巢癌组织及细胞系中的表达及对耐药情况的研究,并进一步验证了 HDAC1对miR-34a的靶标作用,对研究卵巢癌细胞增殖及逆转耐药和后期治疗中新型靶向治疗有重要的意义,为EOC的治疗奠定理论基础,有望对EOC的治疗提供了新思路和方向。第一部分 MiR-34a在卵巢癌组织中的表达及意义研究目的:通过检测miR-34a在卵巢癌组织中的表达,分析其与EOC临床病理特征之间的关系,探讨与卵巢癌的进展、侵袭和转移的关系。研究方法:收集2011年7月～2013年12月青岛大学附属医院EOC病理标本共54例,年龄38～70岁,平均年龄54.2±7.5岁:其中浆液癌48例,粘液癌6例;交界性卵巢肿瘤12例,年龄31～60岁,平均年龄46.9±8.1岁,其中浆液性8例,粘液性4例,正常卵巢组织1 0例,年龄48～59岁,平均年龄52.3±3.4岁,均为因子宫肌瘤而切除卵巢者。所有患者均签署知情同意书,并且经青岛大学附属医院伦理委员会审批通过。通过RT-qPCR方法检测miR-34a的表达,分析其表达与卵巢癌临床病理特征之间的关系,验证miR-34a的表达与卵巢癌的进展、侵袭和转移的密切关系。研究结果1.MiR-34a在卵巢肿瘤及正常卵巢组织中的表达:EOC组织中miR-34a相对表达量为0.5471±0.1 526,明显低于交界性卵巢肿瘤患者(0.9426±0.0849)和正常卵巢组织(1.03 75±0.0817),差别具有统计学意义(P0.001),后两者比较无统计学意义(p=0.998)(见图 1.2 和表 1.4);2.卵巢癌组织中miR-34a表达与临床病理特征的关系:2.1卵巢癌组织中miR-34a的表达与FIGO临床分期的关系:EOCⅠ期、Ⅱ期患者中miR-34a的相对表达量为0.77 15± 0.0813,Ⅲ、Ⅳ期miR-34a的相对表达量为0.4608±0.0501,差别具有统计学意义(p=0.022)(见图1.3和表1.5)。2.2卵巢癌组织中miR-34a的表达与EOC淋巴转移的关系:9例淋巴结转移患者miR-34a的相对表达量为0.4511± 0.0610,而无淋巴结转移患者miR-34a的相对表达量为0.5663±0.1 5 84;EOC组织中 miR-34a表达水平与淋巴结转移呈负相关,差别具有统计学意义(P=0.002)(见图1.4和表1.5)。2.3卵巢癌组织中miR-34a的表达与EOC分化程度的关系:高级别腺癌组织中相对表达量为0.5236±0.1314,而低级别腺癌组织为 0.8413±0.0668,两者无明显统计学差异(p=0.193)(见表1.5)。2.4卵巢癌组织中 miR-34a的表达与年龄的关系:年龄≤50岁EOC患者miR-34a的相对表达量0.5642±0.1715,年龄50岁患者的表达量为 0.547 1±0.1 526,两者无明显统计学差异(P=0.194)(见表 1.5)。2.5卵巢癌组织中 miR-34a的表达与组织学分类的关系:在粘液性腺癌miR-34a表达量为0.6128±0.2033,浆液性腺癌miR-34a表达量为 0.538 9±0.1457,两者无明显统计学差异(p=0.112)(见表1.5)。2.6卵巢癌组织中 miR-34a的表达与 CA125水平的关系:在CA125≤200U/ml 的患者中 miR-34a 相对表达量为0.7770±0.0946,CA125200U/m1 的患者中 miR-34a 相对表达量为0.507 1±0.1 225,两者无明显统计学差异(p=0.5 83)(见表 1.5)。研究结论:MiR-3 4a的低表达与上皮性卵巢癌的进展相关。第二部分MiR-34a对卵巢癌细胞的增殖能力及顺铂耐药性作用的机制研究研究目的:探讨miR-34a在卵巢癌细胞增殖及顺铂耐药中的作用,并研究其作用的分子机制。研究方法:采用 MTT 法和软琼脂集落形成实验测定卵巢癌细胞系(SKOV3 和 OVCA433)中细胞的增殖及耐药情况;采用 RT-qPCR检测miR-34a在SKOV3和OVCA433中相对表达情况;培养卵巢癌耐药细胞系SKOV3cp(将SKOV3细胞采用顺铂药物诱导培养 6个月);采用 miR-34a mimics 和 miR-34ainhibitor转染 SKOV3,OVCA433 和 SKOV3cp;real time P CR 检测SKOV3和 SKOV3cp细胞中极短期(48h+4μg/ml)顺铂干预对于SKOV3中miR-34a表达水平的影响;采用不同浓度的顺铂(0,0.5,1,2,4,8μg/ml)处理 SKOV3/SKOV3cp/SKOV3 cp+miR-34a 和 SKOV3/SKOV3 cp/SKOV3+miR-34a inhibitor 细胞,并测定细胞在不同顺铂浓度下的存活率。研究结果1 miR-34a模拟物对卵巢癌细胞存活率的影响:两种卵巢癌细胞系SKOV3和OVCA433分别转染了 miR-34a模拟物,同时分别对两个细胞系转染了乱序 miRNA,作为阴性对照组。转染后 1-5天,分别对两种细胞系进行细胞生长抑制情况的评估。SKOV3生长抑制率为 0.075 ± 0.005、0.138±0.011、0.245±0.026、0.467±0.038、1.045±0.13 6;OVAC433 生长抑制率分别为0.051±0.007、0.138±0.013、0.245±0.023、0.467±0.035、1.045±0.1 13。结果显示随着时间的延长,不论是否转染miR-34a,SKOV3 和 OVCA433 细胞在不断增殖,与转染了乱序miRNA的对照组,转染了 miR-34a模拟物的两类卵巢癌细胞系细胞相对存活率都明显低于对照组,差异具有显著性(p0.001)(见图2.1、图2.2、表2.1及表2.2)。2 miR-34a模拟物对卵巢癌细胞集落形成的影响:软琼脂集落形成实验结果:转染miR-34a模拟物后,SKOV3细胞系:对照组集落计数为210.3±19.5,实验组集落计数为 146.5±9.6,差异具有统计学意义p=0.0022;OVCA43 3细胞系:对照组集落计数为200±35.2,实验组集落计数为 118.25±7.1,差异具有统计学意义(p=0.0076);实验组相对于对照组,SKOV3和 OVCA433平均细胞集落数目分别降低了约29%和42%(见图2.3和图2.4)。3 miR-34a抑制物对卵巢癌细胞生长抑制的影响:分别对两种卵巢癌细胞系SKOV3和OVCA433分别转染miR-34a抑制物,阴性对照组则为未转染miR-34a抑制物的卵巢癌细胞。转染后等待24小时,在此后的1-5天,分别对两种细胞系进行了 MTT分析,以此评估生长抑制率。SKOV3生长抑制率分别为 0.075±0.007、0.187±0.023、0.502±0.034、0.987±0.047、1.965±0.146;OVAC433 生长抑制率分别为 0.075±0.007、0.157±0.028、0.432+0.024、0.837±0.077、1.765 ± 0.096。结果表明,随着培养时间的增加,转染了 miR-3 4a抑制物的两类卵巢癌细胞系中,细胞的相对存活率较对照组出现了明显提高,两组之间的存活率差异具有显著性(p0.001)(见图2.5、图2.6、表2.3和表2.4)。4 miR-34a抑制物对卵巢癌细胞的细胞集落形成的影响:软琼脂集落形成实验结果:转染miR-34a抑制物后,SKOV3细胞系:对照组集落计数为1 7 6.5±3 4.6,实验组集落计数为2 42.0±1 1.9,差异具有统计学意义(p=0.02);OVCA433细胞系:对照组集落计数为 173.5±14.2,实验组集落计数为 228.5±9.8,差异具有统计学意义(p=0.00 1 5)(见图2.7和图2.8)。结果显示当抑制miR-34a表达后,实验组相对于对照组,SKOV3和OVCA433平均细胞集落数目分别增加了约40%和3 6%。5 SKOV3和SKOV3cp细胞中的miR-34a的表达水平:采用实时定量PCR技术分析了 SKOV3和SKOV3cp细胞中的miR-34a的表达水平,其结果见图2.9。图中miR-34a在SKOV3细胞中的相对表达水平(1.00±0.23)高于 SKOVcp(0.38±0.11)的两倍以上,这表明在 SKOV3cp的细胞系中,miR-34a的表达出现非常明显的下调,显著性达到了 p0.0 1。6短期顺铂(浓度4μg/ml+48h)处理对miR-34a表达的影响:对SKOV3细胞进行短期顺铂处理,药物浓度同耐药细胞株培养方法。采用实时定量PCR检测其miR-34a的表达水平,发现miR-34a在SKOV3细胞中的相对表达水平(1.00±0.1 5)为接受顺铂短期处理的SKOV3细胞的两倍以上(0.45±0.08),表明即便是接受短期顺铂处理的SKOV3的细胞系中,miR-34a的表达也出现了非常明显的下调倍,显著性达到了 p0.01(见图2.10)。7 miR-34a过表达对于顺铂处理抗药性的影响:应用 SKOV3和SKOV3cp细胞,同时对SKOV3cp细胞转染了 miR-34a,以此模拟具有顺铂耐药性细胞中 miR-34a过表达时对于化疗药物的影响。转染24小时后,采用不同浓度的顺铂(0,0.5,1,2,4,8μ g/ml)处理这三类细胞,MTT结果显示当顺铂给药浓度增加时其存活率均明显下降。与SKOV3细胞相比,当暴露于相同浓度的顺铂时,SKOV3cp细胞的存活率显著增高(p0.001)。与未转染miR-34a 的 SKOV3cp 细胞比较,转染 miR-34a 的 SKOV3cp 细胞的存活率下降(p0.001)(见图2.1 1)。8 miR-34a表达抑制对于顺铂处理抗药性的影响:实验中仍然采用两类细胞:SKOV3和SKOV3cp细胞,但是与上述实验不同的是,将 SKOV3 转染了 miR-34a抑制剂,模拟 SKOV3 细胞中miR-34a表达被抑制时,卵巢癌细胞对化疗药物的相应反应。结果显示:转染24小时后采用不同浓度的顺铂(0,0.5,1,2,4,8μg/ml)处理这三类细胞,MTT结果显示当顺铂给药浓度增加时其存活率均明显下降。与未转染miR-34a的 SKOV3细胞比较,转染miR-34a抑制剂的SKOV3细胞的增殖能力显著增强,不同浓度顺铂对于癌细胞的抑制能力减弱,其显著性达到了 p0.001(见图 2.1 2)。研究结论:第三部分HDAC1对于miR-34a的靶标功能及对细胞增殖和顺铂耐药性作用的研究研究目的:1.通过预测 miR-34a的靶基因,进而研究靶基因在卵巢癌中的功能及表达的作用;2.验证miR-34a是否可以通过抑制靶基因的表达,以抑制卵巢癌细胞的增殖并逆转耐药性。研究方法通过生物信息学分析预测了 miR-34a的75 1个潜在靶标,并选择1 4个癌症相关基因用于进一步检测过表达转染miR-3 4a模拟物后相关基因的变化;构建含有荧光素酶编码序列的报告载体,连接上述潜在miR-34a作用靶标的3'-UTR,并进行双荧光素酶报告基因测定;Western-Blot验证卵巢癌细胞HDAC1表达特性以及与 miR-34a的调控关系;MTT法和软琼脂集落形成实验测定HDAC1 基因表达对卵巢癌细胞活性的影响;real time PCR、Western-Blot及MTT法验证HDAC1基因表达对顺铂对卵巢癌细胞耐药性的影响;构建HDAC1过表达质粒,采用MTT法和软琼脂集落形成实验检测 HDAC1 过表达对 miR-34a 转染的SKOV3和SKOV3cp细胞增殖的影响。研究结果1.miR-34a潜在靶基因筛选与分析:通过生物信息学分析预测并初步筛选了 miR-34a的 14种与癌症相关的基因RT-PCR检测发现在卵巢癌细胞系中过表达miR-34a会导致其中六种基因表达出现变化(Sox4,HDAC1,ITGB8,CDH4,TCF12 和 WNT1);随后双荧光素酶报告基因测定结果显示TCF12和HDAC1的表达差异具有统计学意义,其中 HDAC1 荧光素酶活性抑制最为明显(p0.001)(见图 3.1 和 3.2);2.miR-34a对 HDAC1 表达的抑制作用:HDAC1 基因的 3'-UTR互补位点中引入突变并转染 miR-34a mimics:未引入突变1.miR-34a的过表达可有效的抑制卵巢癌细胞的增殖;2.miR-34a的过表达对逆转顺铂耐药有一定作用,为卵巢癌的潜在治疗靶点提供了理论基础。组的荧光活性抑制表现依然显著(p0.001),突变组中,由于miR-34a和HDAC1相互作用的中断,抑制不再显著(见图3.3和3.4);3.卵巢癌细胞HDAC1表达特性以及与miR-34a的调控关系:电泳实验结果显示转染 miR-34a mimics 能够抑制 SKOV3,OVCA43 3和SKOV3cp细胞中的HDAC1表达(见图3.5);4.HDAC1基因表达对卵巢癌细胞活性影响:采用 HDAC1 过表达质粒或HDAC1 siRNA转染SKOV3细胞作为实验组,未转染组作为阴性对照组。转染后 1-5天,MTT法对细胞生长情况进行评估。过表达HDAC1组SKOV3生长率为0.079±0.005、0.398±0.010、0.690±0.009、1.132±0.121、1.893±0.089,转染HDAC1 siRNA 组 SKOV3 生长率为 0.071 ± 0.005、0.312 ±0.014、0.456 ± 0.00 7、0.517±0.114、1.236±0.089,与未转染组相比,差别具有显著意义(P0.001)。软琼脂集落形成实验结果显示与对照组(集落计数228.3±8.8)相比,HDAC1过表达组(集落计数296.3±24.5)能够显著促进软琼脂中SKOV3细胞的集落形成。与对照组(集落计数 211.3±9.7)相比,当HDAC1 表达沉默时(集落计数 153.8±15.0),SKOV3细胞的集落形成显著受到抑制(P0.0 1)(见图 3.6、3.7、3.8和表3.1、3.2);5.HDAC1对顺铂在卵巢癌细胞敏感性影响:RT-PCR结果显示SKOV3细胞中 HDAC1-mRNA表达水平远低于 SKOV3cp细胞,Western-Blot结果说明SKOV3细胞中HDAC1蛋白质表达水平也远低于 SKOV3cp细胞(p0.01),HDAC1 过表达可显著提高顺铂处理后SKOV3细胞的存活率(p0.001)(见图3.9、3.10、3.11 和表 3.3);6.HDAC1过表达对miR-34a转染的SKOV3或SKOV3cp的影响:MTT和软琼脂集落形成实验均显示miR-34a抑制SKOV3细胞的活力和集落形成,HDAC1过表达能够逆转上述抑制作用,;顺铂处理可导致 SKOV3 细胞活力的显著降低(约 60%),对SKOV3cp细胞活力几乎没有影响(约 1 5%),而采用miR-34a转染的 SKOV3cp细胞,细胞活力则降至 50%左右,若同时转染HDAC1过表达质粒,细胞对顺铂的敏感性再次降低,细胞活力降低至只有20%左右,差别均具有统计学意义(p0.001)(见图3.12、3.13、3.14)。研究结论:1.HDAC1是miR-3 4a的功能靶点,HDAC1的过表达增强了卵巢癌细胞的增殖能力,并与顺铂耐药性呈正相关;2.miR-34a通过靶向抑制HDAC1进一步抑制卵巢癌细胞增殖并逆转顺铂耐药性。
【图文】：

溶解曲线,卵巢组织,卵巢癌组织,卵巢肿瘤

实验结果逡逑１邋ＭｉｃｒｏＲＮＡ－３４ａ在卵巢肿瘤及正常卵巢组织中的表达逡逑实时定量ＰＣＲ检测此反应的溶解曲线（图１．１）为单峰，表逡逑明无非特异性荧光产生，定量准确。卵巢癌组织中ｍｉＲ－３４ａ相对逡逑表达量为０．５４７１±０．１邋５２６，明显低于交界性卵巢肿瘤患者逡逑（０．９４２６±０．０８４９邋）和正常卵巢组织（１邋＿邋０邋３邋７邋５邋土０邋？邋０邋８邋１邋７邋），差异有逡逑统计学意义（Ｐ邋＝邋0．000），后两者比较无统计学意义（ｐ邋＝邋0．９９８邋）逡逑（见表１．４和图１．２邋）。逡逑ＲＮＵ６Ｂ逡逑ｉｊ逦ｍｉＲ－３４ａ逡逑，逦／邋Ｉ邋＇ｈ逡逑ｉ逦／＇逦＼逡逑４逦＿逦逦邋—逡逑Ｉ逦＊■■■邋ｉｉ逡逑．邋｜邋，逡逑５逦＾逦？逦？逦ｎ

溶解曲线,卵巢组织,内参,卵巢癌组织

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