LncRNA-AC002454.1上调CDK6的表达对子宫内膜异位症患者在位内膜细胞细胞周期紊乱的调控机制研究

发布时间：2020-06-13 10:23

【摘要】：目的:子宫内膜异位症(Endometriosis,EMS,内异症)在妇科领域是一种依赖于雌激素的慢性常见病,自身细胞功能障碍可能是该病病因。其典型的临床表现为盆腔肿块和痛经,可引起慢性盆腔疼痛,不孕等疾病,并具有广泛植入和恶性肿瘤侵袭性生长能力等生物学行为。关于EMS的文献提示在位内膜自身的分子生物学特性与正常子宫内膜有很大区别,例如迁徙、侵袭、增殖、凋亡和血管生成能力等,这些现象可能是基因水平的表达差异引起的,而且在子宫内膜处于分泌期时,相应生物学功能更强。最近的研究发现,在位内膜的细胞周期相关基因的异常表达同样会引起内异症。本课题组前期通过对内异症在位内膜和正常子宫内膜的长链非编码RNA(long non-coding RNA、lncRNA)芯片筛查结合生物信息学分析,发现其中AC002454.1基因是差异表达的基因之一。AC002454.1是一种天然反义lncRNA。反义lncRNA起作用的经典模式是与相邻基因的mRNA形成RNA-RNA二聚体,改善相邻基因的mRNA的稳定性,从而上调相邻基因的表达。根据与正义链编码基因重叠方向和长度,又将反义lncRNA的作用形式分为头对头、尾对尾和完全重叠。在芯片分析中,AC002454.1与其相邻的周期蛋白依赖性激酶-6(Cyclin-dependent kinase 6,CDK6)基因相关,两者均位于7号染色体,有长约139个核苷酸的重叠区。AC002454.1与CDK6以头对头重叠的形式存在,即反义链5’端序列与正义链的5’端序列互补。并且已经通过实时荧光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction、qRT-PCR)实验验证,内异症患者在位内膜中AC002454.1 mRNA相对表达量明显增高并且与CDK6 mRNA正相关。CDK6是细胞周期调节中发挥重要作用的蛋白激酶,在细胞G1期中结合CyclinD1,磷酸化下游pRb,释放结合的转录因子E2F,使细胞周期的进程得以启动,同时启动细胞增殖相关基因的转录。芯片分析中CDK6是在pathway分析排在首位的细胞周期通路中差异倍数最高的mRNA,GO分析也提示差异mRNA转录本主要与细胞周期有关。CDK6除了作为激酶的活性功能外,可以增强血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)表达水平,促进血管生成及内皮细胞生长。CDK6的作用机制与内异症形成过程相吻合,即在位内膜细胞随经血逆流后进入盆腔后需黏附在异位部位、进而通过血管生成,细胞侵袭等过程,种植于异位部位。因此得出推测:CDK6功能异常可引起子宫内膜细胞细胞周期紊乱,逃逸免疫清除,细胞生物学特性增强,而AC002454.1在内异症中的作用可能通过对CDK6的调节来实现,共同参与内异症的发病过程。本研究拟利用组织实验、体外细胞实验探讨AC002454.1和CDK6在内异症发病中的作用及机制,为内异症的发病机制研究提供理论基础。研究方法:采用qRT-PCR检测内异症在位内膜组织和异位内膜组织及正常子宫内膜组织中AC002454.1和CDK6 mRNA的表达情况并进行相关性分析。利用蛋白免疫印迹方法(Western blot)和免疫组化方法检测正常子宫内膜组织,内异症在位内膜组织和异位内膜组织中CDK6蛋白的表达情况。借助于原代细胞培养技术、qRT-PCR、Western blot技术对内异症患者在位内膜间质细胞和正常子宫内膜间质细胞中AC002454.1和CDK6的表达量进行检测。分别下调内异症患者在位内膜间质细胞中AC002454.1和CDK6表达量,分别上调正常子宫内膜间质细胞中AC002454.1和CDK6表达量,qRT-PCR和Western blot检测慢病毒转染前后AC002454.1和CDK6 mRNA和蛋白表达水平的改变,以及细胞周期相关蛋白pRb、cyclinD1、E2F的改变。CCK-8细胞增殖实验检测AC002454.1和CDK6表达变化的前后细胞增殖能力的改变。划痕实验对AC002454.1和CDK6表达变化前后细胞迁移能力进行检测,Transwell细胞侵袭实验对AC002454.1和CDK6表达变化前后细胞侵袭能力进行检测,流式细胞技术对AC002454.1和CDK6表达变化前后细胞周期分布进行检测。利用RNA纯化染色质分离实验和蛋白质谱分析检测与AC002454.1特异性相互作用的蛋白。利用qRT-PCR对AC002454.1特异性相互作用的蛋白在内异症在位内膜间质细胞中的mRNA表达水平进行验证,并分析与AC002454.1和CDK6表达的相关性。结果:1、qRT-PCR结果提示:AC002454.1和CDK6 mRNA相对表达量在内异症患者异位及在位内膜组织中明显高于正常内膜组织(P0.05),而异位内膜组织和在位内膜组织之间表达量没有显著差异(P0.05)。在位内膜组织与正常内膜组织中AC002454.1和CDK6 mRNA相对表达量呈正相关(Pearson相关系数为:0.691,P0.001)。Western blot结果提示:内异症患者在位内膜组织中CDK6蛋白相对表达量明显高于正常内膜组织(P0.05),而异位内膜组织和在位内膜组织之间表达差异不显著(P0.05)。免疫组化结果提示:CDK6蛋白主要表达在子宫内膜间质细胞的细胞质及细胞核中。CDK6蛋白在正常内膜组织中表达的阳性率为15.0%,在内异症患者在位和异位内膜组织中CDK6蛋白阳性率为82.0%和68%,以上结果提示,CDK6蛋白在内异症在位内膜组织中表达阳性率明显高于正常子宫内膜组织(P0.05),而内异症异位内膜组织和在位内膜组织之间表达无显著差异(P0.05)。2、体外细胞实验中,qRT-PCR提示:与每组相对应的空白对照组和阴性对照组结果相比,内异症在位内膜间质细胞下调AC002454.1表达量后AC002454.1表达明显降低(P0.05),上调AC002454.1毒的正常子宫内膜间质细胞中AC002454.1表达明显升高(P0.05),下调CDK6表达后,内异症在位内膜间质细胞中CDK6表达水平明显降低(P0.05),上调CDK6表达后,正常子宫内膜间质细胞中CDK6表达水平明显升高(P0.05),说明转染成功。沉默AC002454.1组内异症在位内膜间质细胞中CDK6 mRNA表达量下降(P0.05),过表达AC002454.1组正常子宫内膜间质细胞中CDK6 mRNA表达量增高(P0.05)。Western blot结果提示:AC002454.1下调组内异症在位内膜间质细胞中CDK6蛋白表达量下降(P0.01),pRb、cyclinD1、E2F蛋白表达量下降(P0.05)。AC002454.1上调组正常子宫内膜间质细胞中CDK6蛋白表达量增高(P0.05),pRb、cyclinD1、E2F蛋白表达量上升(P0.05)。CCK8实验检测结果提示:内异症在位内膜间质细胞在沉默AC002454.1后增殖能力明显降低(P0.05),沉默CDK6后增殖能力明显降低(P0.05),正常内膜间质细胞在上调AC002454.1后增殖能力显著增高(P0.05),过表达CDK6后增殖能力明显增高(P0.05)。划痕实验检测结果提示:内异症在位内膜间质细胞在下调AC002454.1后迁移能力明显降低(P0.01),沉默CDK6后迁移能力明显降低(P0.01),正常内膜间质细胞在上调AC002454.1后迁移能力增高(P0.01),过表达CDK6后迁移能力明显增高(P0.01)。Transwell侵袭实验结果提示:内异症在位内膜间质细胞沉默AC002454.1后侵袭能力明显降低(P0.01),沉默CDK6后侵袭能力明显降低(P0.01),正常子宫内膜间质细胞过表达AC002454.1后侵袭能力明显增高(P0.01),过表达CDK6后侵袭能力明显增高(P0.01)。流式细胞技术检测结果提示:内异症在位内膜间质细胞沉默AC002454.1后细胞G0/G1期比例明显增加,S期比例明显减少(P0.01),沉默CDK6后细胞G0/G1期比例明显增加,S期比例明显减少(P0.01),正常子宫内膜间质细胞过表达AC002454.1后细胞G0/G1期比例明显减少,S期比例明显增加(P0.01),过表达CDK6后细胞G0/G1期比例明显减少,S期比例明显增加(P0.01)。3、RNA纯化染色质分离技术联合蛋白质谱分析检测结果提示:与AC002454.1特异性相互作用的蛋白共有37个。STRING数据库分析提示:其中热休克蛋白90AB1(heat shock protein 90 k Da alpha,class B member 1,HSP90AB1)和CDK6存在蛋白相互作用关系,预测分数为0.472,在其他物种中相互作用分数为0.668。HitPredict数据库提示二者相互作用分数为0.665。qRT-PCR提示:HSP90AB1 mRNA在内异症在位内膜间质细胞中表达高于正常子宫内膜间质细胞(P0.05),并且HSP90AB1 mRNA表达量与AC002454.1、CDK6 mRNA表达量呈正相关(Pearson相关系数分别为0.980和0.895、P0.01)。结论:1、AC002454.1和CDK6在内异症在位内膜中均高表达,并呈正相关,两者均有促进在位内膜间质细胞增殖、迁移、侵袭的能力。AC002454.1和CDK6可能通过影响在位内膜细胞生物学特性参与内异症的疾病发展。2、在在位内膜间质细胞中调节AC002454.1的表达后,CDK6 mRNA及蛋白表达相应发生变化,细胞周期相关蛋白pRb、cyclinD1、E2F随之变化,细胞G0/G1期和S期比例发生改变。AC002454.1调节CDK6的表达可能是内异症在位内膜细胞周期紊乱等分子生物学异常的分子机制。3、AC002454.1特异性相互作用的蛋白HSP90AB1,与CDK6蛋白之间也存在蛋白互作关系并且在内异症在位内膜细胞中表达相关。说明AC002454.1可能通过HSP90AB1作为桥梁,进而影响CDK6蛋白,从而对内异症产生作用,即HSP90AB1可能是CDK6的下游靶基因之一,有待进一步验证。
【图文】：

子宫内膜组织,内膜

中国医科大学博士学位论文3 结果3.1 子宫内膜异位症患者异位及在位内膜组织中 AC002454.1 和CDK6 mRNA 表达情况qRT-PCR 检测子宫内膜组织中 AC002454.1 和 CDK6 mRNA 表达情况。结果见图 1.1A，GAPDH 作为内参，内异症在位内膜组织中 AC002454.1 和 CDK6mRNA 表达高于正常内膜组织（P<0.05），而内异症患者异位内膜组织和在位内膜组织之间表达差异并不显著（P > 0.05）。对 AC002454.1 和 CDK6 mRNA 在内异症在位内膜组织与正常内膜组织中的表达量进行相关性分析，结果见图1.1B，AC002454.1 和 CDK6 mRNA 相对表达量呈正相关（Pearson 相关系数为：0.691，P<0.001）。

子宫内膜组织,蛋白表达

图 1.2 子宫内膜组织 CDK6 蛋白表达图中 A 为子宫内膜组织中 CDK6 蛋白电泳图；B 为 CDK6 蛋白在子宫内膜组织相对表达量。NE：正常子宫内膜组织，EU：内异症在位内膜组织，EC：异位内膜组织。3.2.2 免疫组化检测情况免疫组化结果提示：CDK6 蛋白主要表达在间质细胞的细胞质及细胞核中（图 1.3）。正常内膜组织中 CDK6 蛋白表达的阳性率为 25.0%，内异症在位内膜组织和异位内膜组织 CDK6 蛋白阳性率分别为 73.0%和 66.7%。该结果表明，，内异症患者在位内膜中 CDK6 蛋白的阳性表达率明显高于正常子宫内膜（P<0.05），而异位内膜和在位内膜之间无显著差异（P > 0.05）（表 1.2）。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R711.71

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