维生素D关键代谢酶—诱导型CYP24A1对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响

发布时间：2020-06-13 15:45

【摘要】：目的:卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,有侵袭性强、迁移能力强、复发率高的特点。近年来对维生素D非经典作用的研究表明,活性维生素D(1a,25-dihydroxy-vitaminD_3,1α,25(OH)_2D_3)有抑制肿瘤细胞增殖、促进分化的功能。但是,在课题组前期建立的小鼠卵巢表面上皮细胞自发恶性转化模型中,长期使用1α,25(OH)_2D_3处理后,随着细胞恶性程度的增加我们发现1α,25(OH)_2D_3抑制增殖的能力减弱了,而在这过程中CYP24A1基因异常升高数千倍。CYP24A1基因编码的24-羟化酶是维生素D代谢过程中的关键酶,它可以使1α,25(OH)_2D_3生成活性极低的代谢产物,从而维持血钙浓度稳定。CYP24A1在正常组织中的表达水平较低,然而有研究结果表明,肿瘤组织CYP24A1的表达增高,并且在1α,25(OH)_2D_3处理后其表达水平进一步异常升高。为了研究诱导型CYP24A1是否拮抗了1α,25(OH)_2D_3的抗肿瘤效果,本研究建立了稳定CYP24A1低表达和过表达的卵巢癌细胞系,通过分析诱导型CYP24A1对卵巢癌细胞增殖和迁移能力的影响,以及其对卵巢癌细胞化疗药物敏感性的改变,初步探讨诱导型CYP24A1对1α,25(OH)_2D_3抑制卵巢癌细胞增殖和迁移能力的影响。同时,利用基因芯片技术分析与诱导型CYP24A1共表达基因表达的变化情况,探究诱导型CYP24A1影响活性维生素D抗肿瘤的分子机制。为深入了解维生素D在肿瘤防治方面的应用提供可靠研究资料。方法:本研究分为两个部分,(1)诱导型CYP24A1对1α,25(OH)_2D_3抑制卵巢癌细胞增殖和迁移能力的影响:建立稳定低表达和过表达CYP24A1的卵巢癌细胞系。平板克隆检测1α,25(OH)_2D_3对不同CYP24A1表达水平的卵巢癌细胞增殖能力的影响。划痕实验检测1α,25(OH)_2D_3对不同CYP24A1表达水平的卵巢癌细胞迁移能力的影响。使用CCK-8实验检测细胞活力,分析不同CYP24A1水平是否影响了卵巢癌细胞对1α,25(OH)_2D_3和卡铂联合作用的敏感性。(2)1α,25(OH)_2D_3诱导CYP24A1上调的相关基因表达谱分析:使用CYP24A1启动子序列改造荧光素酶报告系统,加入1α,25(OH)_2D_3处理因素,分析其对CYP24A1启动子的诱导情况,并用qRT-PCR检测1α,25(OH)_2D_3对卵巢癌细胞CYP24A1基因表达的影响。使用100 nmol/L的1α,25(OH)_2D_3处理SKOV-3细胞,利用基因芯片技术,分析差异表达的基因以及其中与CYP24A1有共表达关系的基因,并实验qRT-PCR方法进行验证。anti分析诱导型CYP24A1影响1α,25(OH)_2D_3抑制肿瘤细胞增殖和迁移能力的可能机制。结果:(1)减少CYP24A1的表达对1α,25(OH)_2D_3抑制卵巢癌细胞增殖和迁移能力的影响:通过基因水平和蛋白水平的验证,我们成功建立了CYP24A1基因稳定低表达和过表达的卵巢癌SKOV-3和OVCAR-8细胞系。在1α,25(OH)_2D_3处理后,CYP24A1基因敲低组细胞增殖能力显著低于阴性对照组(p0.001),并且CYP24A1过表达组细胞增殖能力显著高于阴性对照组(p0.05)。这说明CYP24A1敲低后可以增强1α,25(OH)_2D_3抑制增殖的作用,同时CYP24A1基因过表达后则表现出对1α,25(OH)_2D_3抑制增殖作用的抵抗。平板克隆结果表明,在SKOV-3细胞中,CYP24A1敲低组细胞的克隆形成能力显著低于阴性对照组(p0.001),并且在阴性对照组中1α,25(OH)_2D_3使其克隆形成率下降了59.78%,而1α,25(OH)_2D_3使CYP24A1敲低组细胞的克隆形成率下降了76.82%。这说明减少CYP24A1表达不仅可以降低卵巢癌细胞的增殖能力,还可以提高1α,25(OH)_2D_3对细胞增殖的抑制能力。划痕实验结果显示,阴性对照组中1α,25(OH)_2D_3没有显著改变细胞迁移指数,而在CYP24A1敲低组细胞中细胞迁移指数则显著降低(p0.05)。并且在OVCAR-8细胞中,CYP24A1敲低组细胞的迁移指数也显著低于阴性对照组(p0.05)。这说明减少CYP24A1表达不仅可以降低卵巢癌细胞的迁移能力,还可以提高1α,25(OH)_2D_3对细胞迁移的抑制能力。(2)CYP24A1的表达水平对卵巢癌细胞1α,25(OH)_2D_3联合卡铂处理敏感性的影响:CCK-8实验结果显示,1α,25(OH)_2D_3单独处理卵巢癌细胞时,从48小时开始,细胞存活能力显著下降,并且细胞活力随处理时间的延长而下降,呈时间依赖性(p0.05)。卡铂单独处理卵巢癌细胞时,细胞活力随卡铂浓度的升高而下降,呈剂量依赖效应(p0.001)。后续实验选择低浓度卡铂(20 mg/L)联合1α,25(OH)_2D_3(100 nmol/L)处理48小时,观察联合作用对卵巢癌细胞化疗药物增敏的效果。实验结果显示,100 nmol/L的1α,25(OH)_2D_3单独处理、20 mg/L的卡铂单独处理以及联合处理,均可以显著降低细胞的存活能力(p0.001),并且1α,25(OH)_2D_3增强了卡铂的抗增殖效果(p0.001),与80 mg/L的卡铂单独处理组的抑制作用相似。说明1α,25(OH)_2D_3可以显著提高卵巢癌细胞对卡铂的敏感性,我们还观察到CYP24A1敲低组细胞还可以进一步降低联合作用的细胞存活能力。(3)1α,25(OH)_2D_3对CYP24A1启动子活性的影响:荧光素酶活性检测实验结果表明,1-100 nmol/L 1α,25(OH)_2D_3处理可以显著提高SKOV-3细胞CYP24A1启动子的活性;100 nmol/L 1α,25(OH)_2D_3处理SKOV-3细胞12小时后可以显著提高CYP24A1启动子活性。这说明CYP24A1启动子活性的提高主要与1α,25(OH)_2D_3处理时间有关,与1α,25(OH)_2D_3的浓度关系不大。在CYP24A1基因敲低后,使用1α,25(OH)_2D_3处理后CYP24A1的mRNA仍然会被诱导升高,这说明敲低CYP24A1后并没有减弱1α,25(OH)_2D_3对CYP24A1的诱导程度。(4)1α,25(OH)_2D_3诱导CYP24A1上调的相关基因表达谱分析:本部分研究结果表明,1α,25(OH)_2D_3使SKOV-3细胞的105个基因表达发生显著性改变,其中85个基因表达上调,20个基因表达下调。而且差异表达基因经功能富集后,我们发现差异基因中主要参与调控的包括细胞增殖的正调控、细胞粘附、DNA模板的转录调控等生物学过程,以及影响TGF-βsignaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway等信号通路,这些与1α,25(OH)_2D_3抑制细胞增殖和迁移相关的机制值得深入研究。另外,我们也分析了在这些差异表达的基因中,与CYP24A1有共表达关系的基因共有39个。经过验证分析CYP24A1可能通过影响KIT、TRPV6、IGFBP3、GRK5、IGFBP1等差异基因的表达从而影响了1α,25(OH)_2D_3抑制细胞增殖和迁移的过程。结论:1、减少CYP24A1的表达可以增强1α,25(OH)_2D_3抑制卵巢癌细胞增殖和迁移的能力;2、减少CYP24A1的表达可以提高卵巢癌细胞对1α,25(OH)_2D_3与卡铂联合作用的敏感性;3、CYP24A1启动子活性的提高主要与1α,25(OH)_2D_3的处理时间有关;4、1α,25(OH)_2D_3使SKOV-3细胞的105个基因表达发生显著性改变,其中85个基因表达上调,20个基因表达下调,差异基因涉及TGF-βsignaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway等通路。差异表达的基因中,与CYP24A1基因共表达的有39个,CYP24A1可能通过影响KIT、TRPV6、IGFBP3、GRK5、IGFBP1等差异基因影响1α,25(OH)_2D_3抑制细胞增殖和迁移过程。
【图文】：

图 1.1 CYP24A1 敲低卵巢癌细胞系的建立SKOV-3 细胞稳定敲低 CYP24A1 后，qRT-PCR 结果显示 CYP24A1 的 m平显著降低（A），，Western blot 结果显示 CYP24A1 的蛋白水平降低（VCAR-8 细胞稳定敲低 CYP24A1 后，qRT-PCR 结果显示 CYP24A1 的 mR

图 1.2 CYP24A1 过表达卵巢癌细胞系的建立SKOV-3 细胞稳定过表达 CYP24A1 后，qRT-PCR 结果显示 CYP24A1 的 m平显著升高（A），Western blot 结果显示 CYP24A1 的蛋白水平升高（BVCAR-8 细胞稳定过表达 CYP24A1 后，qRT-PCR 结果显示 CYP24A1 的 m
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31

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本文编号：2711394