缺氧条件下HIF-1α通过调控CXCR4影响滋养细胞侵袭和迁移能力的研究

发布时间：2020-06-13 13:18

【摘要】：胎盘是胎儿和母体间物质交换的重要场所,而滋养细胞是其主要细胞类型,在胚胎植入和胎盘发育中起着至关重要的作用。细胞滋养层细胞侵入子宫螺旋动脉并分化为绒毛外滋养细胞,引起子宫和胎盘血管的重塑。妊娠8~10孕周时,由于绒毛外滋养细胞侵入底蜕膜在螺旋小动脉中聚集形成栓子导致母体血流量不足胎盘组织氧分压较低,不超过20mmHg,随后,滋养细胞栓子崩解母体血液进入胎盘腔循环,氧分压上升到50~60mmHg。在此期间,氧浓度对滋养细胞的侵袭能力起到至关重要的影响,研究表明,滋养细胞侵袭不足引起螺旋动脉重铸障碍导致多种妊娠疾病的发生,如流产,死胎,子痫前期,胎儿宫内受限等。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1 alpha,HIF-1α)是缺氧状态下广泛表达于人体和哺乳动物内的一种转录因子,激活后可以调节其下游多种靶基因的转录,在维持及调控妊娠早期滋养细胞行为中发挥重要作用。滋养细胞侵入子宫的过程与肿瘤细胞侵袭转移的过程相似,不同的是滋养细胞的侵袭性受到严格的时空限制。同时,胎盘发育过程中滋养细胞与母体氧水平的相互作用是调节侵袭过程的重要因素。趋化因子受体4(Chemokine receptor 4,CXCR4)是由352个氨基酸组成的G蛋白偶联受体,与其配体CXCL12结合后可使下游多种信号转导通路激活,调控妊娠早期滋养细胞的侵袭和迁移。研究表明,在缺氧的骨肉瘤细胞中,HIF-1α可以直接结合到CXCR4基因启动子中的缺氧反应元件上,从而上调CXCR4的表达促进肿瘤细胞的侵袭转移。但缺氧条件下HIF-1α与CXCR4及滋养细胞侵袭迁移能力的关系尚未见报道。目的本研究采用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹、Transwell实验和划痕实验,检测人绒毛膜滋养细胞系JEG-3细胞在缺氧条件下HIF-1α、CXCR4 mRNA和蛋白的表达及细胞侵袭和迁移能力的改变,初步探讨HIF-1α在缺氧条件下对滋养细胞CXCR4的表达及细胞侵袭和迁移能力的影响。材料和方法1研究对象人绒毛膜滋养细胞系JEG-3细胞购自北京鼎国昌盛生物科技公司,使用RPMI1640、10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的完全培养基在37℃、5%CO_2饱和湿度恒温培养箱中进行培养,待细胞处于对数生长期时进行干预试验。2方法本研究使用RPMI1640完全培养基将JEG-3细胞悬浮后,置于恒温培养箱中进行培养,待细胞生长至对数期时用胰酶进行消化,接种于培养瓶或六孔板,然后将细胞继续于恒温箱中培养。当细胞生长融合至70%时,对细胞进行后续的处理。2.1缺氧对JEG-3细胞中HIF-1α和CXCR4表达的影响采用终浓度为150μmol/L的氯化钴(cobalt chloride,CoCl_2)分别作用JEG-3细胞12h、24h、48h建立细胞体外缺氧模型。将细胞分为常氧对照组、缺氧12h组、缺氧24h组和缺氧48h组。采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹实验(Western Blot)分别检测各组JEG-3细胞中HIF-1α和CXCR4的mRNA和蛋白表达水平。2.2缺氧条件下沉默HIF-1α对JEG-3细胞中CXCR4的表达和细胞侵袭迁移的影响将JEG-3细胞分为4组:常氧空白组(未加CoCl_2),缺氧空白组(经CoCl_2缺氧处理),缺氧NC组(转染HIF-1α阴性对照再经CoCl_2缺氧处理),缺氧HIF-1αsiRNA组(转染HIF-1αsiRNA再经CoCl_2缺氧处理),使用Real-time PCR和Western Blot分别检测各组细胞HIF-1α和CXCR4的mRNA和蛋白表达水平,Transwell实验和划痕实验检测各组细胞侵袭和迁移能力的变化。3统计学处理所有数据均采用SPSS21.0版本软件进行统计学分析,以?x±s表示实验定量资料数据。多组间数据比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。以α=0.05作为检验标准。结果1缺氧条件下JEG-3细胞中HIF-1α和CXCR4 mRNA的表达Real-time PCR结果显示,HIF-1αmRNA相对表达量在缺氧12h组(1.16±0.25),缺氧24h组(1.07±0.12)和缺氧48h组(1.05±0.17),与常氧对照组(1.03±0.15)相比无明显变化,差异无统计学意义(P0.05)。CXCR4 mRNA相对表达量随缺氧时间的延长逐渐增加,缺氧12h组(4.84±0.28)、缺氧24h组(7.12±0.65)、缺氧48h组(11.19±0.91)明显高于常氧对照组(1.05±0.16),差异均有统计学意义(P0.05)。2缺氧条件下JEG-3细胞中HIF-1α和CXCR4蛋白的表达水平Western Blot结果显示,HIF-1α和CXCR4蛋白的表达水平随缺氧时间的延长均逐渐增加:缺氧12h组(0.66±0.06,0.60±0.04),缺氧24h组(0.91±0.04,0.84±0.07),缺氧48h组(1.11±0.09,1.04±0.07)高于常氧对照组(0.26±0.07,0.38±0.16),差异均有统计学意义(P0.05)。3缺氧条件下沉默HIF-1α后JEG-3细胞中HIF-1α和CXCR4 mRNA的表达3.1缺氧条件下沉默HIF-1α后JEG-3细胞中HIF-1αmRNA的表达Real-time PCR结果显示:缺氧HIF-1αsiRNA组的HIF-1αmRNA表达水平(0.23±0.08),明显低于缺氧空白组(0.98±0.06),缺氧阴性转染组(1.03±0.09)和常氧空白组(1.00±0.11),差异有统计学意义(P0.05)。3.2缺氧条件下沉默HIF-1α后JEG-3细胞中CXCR4 mRNA的表达缺氧HIF-1αsiRNA组CXCR4 mRNA的表达水平(0.44±0.08)明显低于缺氧空白组(6.18±0.79),缺氧阴性转染组(5.83±0.33)和常氧空白组(1.35±0.10),差异有统计学意义(P0.05)。缺氧空白组和缺氧阴性转染组的CXCR4 mRNA表达高于常氧空白组,差异有统计学意义(P0.05)。4缺氧条件下沉默HIF-1α后JEG-3细胞中HIF-1α和CXCR4蛋白的表达Western Blot结果显示,缺氧HIF-1αsiRNA组HIF-1α蛋白和CXCR4表达水平(0.13±0.05,0.30±0.03)均明显低于缺氧空白组(0.88±0.09,0.96±0.06),缺氧阴性转染组(0.82±0.11,0.87±0.07)和常氧空白组(0.29±0.08,0.44±0.07),差异均有统计学意义(P0.05)。缺氧空白组和缺氧阴性转染组的HIF-1α和CXCR4蛋白表达水平高于常氧空白组,差异均有统计学意义(P0.05)。5缺氧条件下沉默HIF-1α后JEG-3细胞侵袭和迁移能力的变化缺氧HIF-1αsiRNA组的细胞侵袭数量和划痕宽度愈合率(34.93±8.01,25.08±4.73)均明显低于缺氧空白组(88.40±5.81,74.63±4.90),缺氧阴性转染组(82.67±4.28,70.22±3.05)和常氧空白组(46.53±4.70,43.89±4.05),差异均有统计学意义(P0.05)。缺氧空白组,缺氧阴性转染组的细胞侵袭数量和划痕宽度愈合率均高于常氧空白组,差异有统计学意义(P0.05)。结论缺氧促进HIF-1α和CXCR4的表达,沉默HIF-1α可能通过CXCR4的下调抑制滋养细胞的侵袭和迁移能力。
【图文】：

缺氧条件,常氧,对照组

l-time PCR 结果显示 ,HIF-1α mRNA 相对表达量在缺氧0.25），，缺氧 24h 组（1.07±0.12）和缺氧 48h 组（1.05±0.17），03±0.15）相比无明显变化，差异无统计学意义（P >0.05）。CXC量随缺氧时间的延长逐渐增加，缺氧 12h 组（4.84±0.28）、缺0.65）、缺氧 48h 组（11.19±0.91）明显高于常氧对照组(1.05±0.学意义（P<0.05），见表 3.1，图 3.1 和图 3.2。表 3.1 缺氧条件下 JEG-3 细胞中 HIF-1α和 CXCR4 mRNA 的表达( x±s分组 HIF-1α CXCR4常氧对照组 1.03±0.15 1.05±0.16缺氧 12h 组 1.16±0.25 4.84±0.28a缺氧 24h 组 1.07±0.12 7.12±0.65a缺氧 48h 组 1.05±0.17 11.19±0.91F 0.29 159.45P 0.83 0.00a 表示与常氧对照组相比，P<0.05，b 表示与缺氧上一组相比 P<0.05。

常氧,缺氧条件,对照组

图 3.2 缺氧条件下 JEG-3 细胞中 CXCR4 mRNA 的表达：a 表示与常氧对照组相比，P<0.05，b 表示与缺氧上一组相比 P<0.05条件下 JEG-3 细胞中 HIF-1α和 CXCR4 蛋白的表达stern Blot 结果显示,HIF-1α和 CXCR4 蛋白的表达水平随缺氧时加：缺氧 12h 组（0.66±0.06，0.60±0.04），缺氧 24h 组（0.7），缺氧 48h 组（1.11±0.09，1.04±0.07）高于常氧对照组（0.6），差异均有统计学意义（P<0.05），见表 3.2，图 3.3。表 3.2 缺氧条件下 JEG-3 细胞中 HIF-1α和 CXCR4 蛋白的表达( x±分组 HIF-1α蛋白 CXCR4 蛋白常氧对照组 0.26±0.07 0.38±0.16缺氧 12h 组 0.66±0.06a0.60±0.04a缺氧 24h 组 0.91±0.04ab0.84±0.07ab缺氧 48h 组 1.11±0.09ab1.04±0.07ab
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.2

【参考文献】