假基因POU5F1B在宫颈癌中的表达及其生物学功能的研究

发布时间：2020-06-19 12:25

【摘要】：目的:POU结构域5类转录因子1B(POU5F1B,POU domain class 5transcription factor 1B)基因,也称OCT4-pg1、OTF3C、OTF3P1和POU5F1P1,是干细胞基因POU转录因子OCT4的假基因之一。本实验研究假基因POU5F1B对宫颈癌(cervical cancer,CC)细胞生物学行为的影响并探索其潜在的作用机制。方法:(1)收集50例宫颈癌手术患者的新鲜癌组织及其配对的癌旁宫颈组织,采用定时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测宫颈组织中假基因POU5F1B的表达水平,并同时检测在宫颈上皮永生化细胞(End1/e6e7细胞)、宫颈癌细胞株(CaSKi,SiHa,C33A和HeLa细胞)中假基因POU5F1B的表达水平。(2)构建POU5F1B下调的CaSKi细胞株,应用qRT-PCR法在mRNA水平测定假基因POU5F1B转染宫颈癌细胞后的表达情况。(3)将人宫颈癌CaSKi细胞分为两组,一组为转染POU5F1B特异性小干扰RNA组(sh-POU5F1B组),一组为阴性对照序列组(sh-NC组)两组细胞,分别采用CCK-8实验、平板克隆形成实验和EDU实验以及细胞生存实验,观察下调假基因POU5F1B对宫颈癌细胞增殖能力的影响;采用Transwell小室细胞侵袭实验检测下调假基因POU5F1B对宫颈癌细胞侵袭能力的影响;利用细胞划痕实验检测下调假基因POU5F1B对宫颈癌细胞迁移能力的影响;利用细胞耐药实验检测下调假基因POU5F1B对宫颈癌细胞对化疗药顺铂敏感性的影响;利用细胞周期实验检测下调假基因POU5F1B对宫颈癌细胞的细胞周期的影响;利用AnnexinV/PI流式细胞凋亡实验、Hoechst33258细胞核染色实验检测下调假基因POU5F1B对宫颈癌细胞凋亡的影响;采用蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot实验检测宫颈癌细胞中下调假基因POU5F1B的表达对其亲本基因OCT4蛋白相对表达量的影响。(4)通过动物实验观察下调POU5F1B的宫颈癌细胞在裸鼠体内移殖瘤的生长变化;最后通过免疫组化实验测定移殖瘤中的OCT4的表达情况。结果:(1)与对照组癌旁宫颈组织相比,假基因POU5F1B在宫颈癌组织中高表达(P0.001);(2)与正常宫颈上皮永生化细胞End1/e6e7细胞相比,CaSKi、SiHa和C33A细胞中假基因POU5F1B均高表达(P均0.01),且在宫颈癌CaSKi细胞中的表达最高,转染后的sh-POU5F1B组和sh-NC组两组细胞中,sh-POU5F1B组CaSKi细胞的POU5F1B的表达量明显低于对照组(P0.01);(3)sh-POU5F1B组CaSKi细胞增殖能力及生长速度明显低于对照组(P0.001);(4)克隆形成实验中,实验组所形成的克隆数量更少大小更小,两组比较P0.01;(5)EDU增殖实验中,实验组细胞中处于增殖分裂期的细胞比例低于对照组(P0.01);(6)sh-POU5F1B组CaSKi细胞的迁移能力明显低于sh-NC组(P0.01);在48h时对照组细胞划痕已基本愈合,而sh-POU5F1B组CaSKi细胞划痕尚未愈合。(7)sh-POU5F1B组CaSKi细胞侵袭能力明显低于对照组(P0.001);(8)与对照组相比,sh-POU5F1B组CaSKi细胞的细胞周期阻滞于G0-G1期(P0.01);(9)sh-POU5F1B组CaSKi细胞的凋亡率明显高于对照组(P0.01);(10)与对照组细胞相比,sh-POU5F1B组CaSKi细胞在相同浓度梯度下,实验组细胞的细胞抑制率明显升高,sh-POU5F1B组细胞的半抑制浓度(IC50)低于对照组(P0.001),即对化疗药顺铂的敏感性高于对照组;(11)与对照组裸鼠相比,sh-POU5F1B组裸鼠体外移殖瘤的肿瘤组织质量低于对照组(P0.001);(12)下调假基因POU5F1B后其亲本基因OCT4蛋白的表达水平下降(P0.001)。结论:假基因POU5F1B在宫颈癌组织中高表达,下调假基因POU5F1B可抑制宫颈癌CaSKi细胞增殖、集落形成、迁移以及侵袭能力,阻滞细胞周期,增加宫颈癌CaSKi细胞对化疗药顺铂的敏感性,并具有促进宫颈癌细胞凋亡的作用。下调假基因POU5F1B抑制裸鼠体内移殖瘤的进展。假基因POU5F1B通过捕获靶向OCT4的miRNA来调节OCT4的表达,从而促进肿瘤的进展。
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33
【图文】：

假基因,宫颈癌组织,宫颈癌,泰兴市

三、实验结果5F1B 在宫颈癌及癌旁组织中的表达水平 1 月至 2017 年 12 月泰兴市人民医院妇产科收治的及其宫颈癌癌旁组织，通过 qRT-PCR 方法检测U5F1B mRNA 的表达量。结果显示在 50 例宫颈达水平明显高于其癌旁组织，且宫颈癌组织中假基旁组织的（2.55±0.27）倍，两者比较，P<0.0011。该结果提示假基因 POU5F1B 可能在宫颈癌中

宫颈癌细胞,假基因,细胞,电镜

因 POU5F1B 在宫颈癌细胞中的表达情况。注：**表B-CaSKi 和 sh-NC-CaSKi 细胞的构建胞转染小干扰POU5F1B shRNA质粒表达载体后，接种至六孔板扩增，得到假基因 POU5F1即 sh-POU5F1B-CaSKi 细胞），按同样方法筛SKi 细胞）。转染 sh-POU5F1B-CaSKi 和 sh-N带红色荧光蛋白，若在电镜下则细胞发出明显OU5F1B shRNA 质粒是已成功转染入细胞中，因此我们可在电镜下观察在红色荧光激发下率，如图 3B, D 显示电镜红色荧光SKi 细胞和对照组 sh-NC-CaSKi 细胞的细胞

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