PCBP1-AS1通过TRAF5介导的NF-κB信号通路调控外阴鳞癌细胞生物学行为的机制研究

发布时间：2020-06-27 10:58

【摘要】：目的:外阴癌在女性生殖器官恶性肿瘤中居第4位,其中以原发性鳞状上皮癌为主。近年来外阴鳞状细胞癌(Vulvar squamous cell carcinoma,VSCC)的发病率有逐年升高,威胁着老年女性的健康,晚期外阴鳞癌的五年生存率仅为20%。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是转录本多于两百个核苷酸,不翻译蛋白质,但能在表观遗传学、转录及转录后三个层面上经多种作用机制对基因表达进行调控的非编码RNA。近年来的大量研究发现,许多lncRNAs的差异性表达或功能异常与包括肿瘤和自身免疫性疾病在内的多种疾病关系紧密,且某些lncRNAs已被证实能够与mRNA、microRNA、相应的靶基因及蛋白质之间进行相互调控,通过某些信号通路参与肿瘤的发生发展,和细胞分化、周期改变、凋亡调控及免疫调节都有一定联系。PCBP1-AS1(poly C binding protein-1 antisense RNA1)是多聚胞嘧啶结合蛋白1的反义lncRNA。反义lncRNA能和其它转录物的特定核苷酸序列互补,经多种作用机制在转录和转录后水平上对靶基因表达进行调控,并可能在疾病发生中发挥独特作用。肿瘤坏死因子受体相关因子5(TNF receptor-associated factor 5,TRAF5)是细胞内重要的信号转导蛋白,既往的研究结果表明,TRAF5可以介导LT-βR、CD40、CD30、CD27等的信号转导进而激活核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)信号转导通路,对细胞的凋亡、炎症反应的发生和免疫调控等都有一定的作用。本研究旨在探究PCBP1-AS1在外阴鳞状细胞癌中的表达情况,验证PCBP1-AS1可以通过TRAF5介导的NF-κB信号通路,调控外阴鳞癌细胞的生物学行为。研究方法:采用实时定量聚合酶链反应法(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)检测19对外阴鳞状细胞癌组织和相应的癌旁正常外阴组织中PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA的表达水平,采用Fisher精确检验进行PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA的相对表达水平与外阴鳞状细胞癌患者临床病理资料的关系分析;采用蛋白印迹法(Western blot,WB)检测19对外阴鳞状细胞癌组织和相应的癌旁正常外阴组织中TRAF5、p65、p-p65、c-Rel和IκBα蛋白的表达水平。通过脂质体转染方法成功地在外阴鳞癌SW954细胞中外源性改变PCBP1-AS1和TRAF5的表达后,采用qRT-PCR法检测PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA的表达水平,CCK-8法检测细胞增殖情况,Annexin V-FITCPI法检测细胞凋亡情况,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell法检测细胞侵袭能力,初步验证PCBP1-AS1和TRAF5在外阴鳞癌SW954细胞中的作用形式和生物学功能。外源性改变PCBP1-AS1和TRAF5的表达后,WB法检测TRAF5、p65、p-p65、c-Rel和IκBα蛋白的表达水平,NF-κB激活—核转运荧光标记法检测细胞中NF-κB的活性变化;在SW954细胞中成功改变PCBP1-AS1和TRAF5表达的基础上,分别应用NF-κB信号通路激活剂和抑制剂,进行NF-κB激活—核转运荧光标记法、CCK-8、Annexin V-FITCPI、划痕实验、Transwell侵袭小室等实验,探究PCBP1-AS1是否通过TRAF5介导的NF-κB信号通路对外阴鳞癌SW954细胞生物学行为进行调控。结果:第一部分:1、VSCC组织中PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA的表达水平均低于相应的癌旁正常外阴组织;2、VSCC组织中PCBP1-AS1的表达水平与患者的肿瘤大小、分化程度、FIGO分期、淋巴结转移、远处转移和鳞状细胞癌相关抗原密切相关,TRAF5 mRNA的表达与患者FIGO分期和淋巴结转移密切相关;3、VSCC组织中TRAF5、p65、p-p65、c-Rel和IκBα蛋白的表达水平均明显低于其相应的癌旁正常外阴组织。第二部分:1、应用shRNA技术成功在SW954细胞中敲低TRAF5的表达,选取沉默效率较高的TRAF5-RNAi-0/SW954细胞用于后续实验;2、PCBP1-AS1的表达上调后TRAF5 mRNA的表达水平随之上调;而TRAF5的表达上调或下调后PCBP1-AS1的表达水平均无明显变化;3、PCBP1-AS1的表达上调能够显著抑制SW954细胞增殖,而TRAF5的表达下调能够显著促进SW954细胞增殖;4、PCBP1-AS1的表达上调能够显著促进SW954细胞凋亡,而TRAF5的表达下调能够显著抑制SW954细胞凋亡;5、PCBP1-AS1的表达上调能够显著抑制SW954细胞迁移,而TRAF5的表达下调能够显著促进SW954细胞迁移;6、PCBP1-AS1的表达上调能够显著抑制SW954细胞侵袭,而TRAF5的表达下调能够显著促进SW954细胞侵袭。第三部分:1、PCBP1-AS1的表达上调后TRAF5、p65、p-p65、c-Rel和IκBα蛋白的表达水平均随之明显上调;而TRAF5的表达下调后p65、p-p65、c-Rel和IκBα蛋白的表达水平均随之明显下调;2、PCBP1-AS1的表达上调能够显著升高NF-κB的活性,而TRAF5的表达下调能够显著降低NF-κB的活性;3、应用NF-κB信号通路激活剂后NF-κB的活性显著升高,而应用NF-κB信号通路抑制剂后NF-κB的活性显著降低,验证了NF-κB信号通路的激活和抑制模型的构建成功;4、NF-κB信号通路的激活能够抑制SW954细胞增殖,NF-κB信号通路的抑制能够促进SW954细胞增殖;NF-κB信号通路的激活能够消减TRAF5的表达下调引起的SW954细胞增殖能力的提高,NF-κB信号通路的抑制能够抵抗PCBP1-AS1的表达上调引起的SW954细胞增殖能力的下降;5、NF-κB信号通路的激活能够促进SW954细胞凋亡,NF-κB信号通路的抑制能够抑制SW954细胞凋亡;NF-κB信号通路的激活能够抵抗TRAF5的表达下调引起的SW954细胞凋亡率的下降,NF-κB信号通路的抑制能够消减PCBP1-AS1的表达上调引起的SW954细胞凋亡率的升高;6、NF-κB信号通路的激活和抑制对SW954细胞的迁移能力无明显影响;7、NF-κB信号通路的激活和抑制对SW954细胞的侵袭能力无明显影响。结论:1、PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA在VSCC组织中表达均降低;在VSCC组织中PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA的表达均与临床病理特征密切相关;VSCC组织中存在着NF-κB/p65和NF-κB/c-Rel信号转导通路的抑制;2、TRAF5是PCBP1-AS1的靶基因,以PCBP1-AS1-TRAF5 mRNA基因对的形式发挥作用;PCBP1-AS1可能作为一种抑癌基因,抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,促进肿瘤细胞凋亡,影响VSCC的发生发展;3、TRAF5介导的NF-κB信号通路参与了PCBP1-AS1在VSCC的发展进程中对肿瘤细胞增殖和凋亡能力的调控。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.35
【图文】：

中国医科大学博士学位论文3 结果PCBP1-AS1 和 TRAF5 mRNA 在 VSCC 组织中均低表达用 qRT-PCR 法对 19 对 VSCC 和相应的癌旁的正常外阴组织内 PCBAF5 mRNA 的表达水平进行检测，结果（图 1.1）显示 VSCC 组织中 PCB水平（0.465±0.384）明显低于其相应的癌旁组织（1.321±0.707），意义（P<0.001）；同时 VSCC 组织内 TRAF5 mRNA 的表达（0.495±低于其相应的癌旁的正常外阴组织（1.336±1.081），差异在统计学P<0.001）。

图 1.2 PCBP1-AS1 和 TRAF5 mRNA 在 VSCC 组织中均低表达BP1-AS1 在人 NNEDV 组织及其相应的病变旁正常外阴组织中的相对表达量 B. mRNA 在人 NNEDV 组织及其相应的病变旁正常外阴组织中的相对表达量PCBP1-AS1 和 TRAF5 mRNA 在 VSCC 和 NNEDV 组织中的表达关系用 Pearson 线性相关分析法分别对 PCBP1-AS1 和 TRAF5 mRNA 在 VV 组织中相对表达的关系进行分析，结果显示在 VSCC 组织中 PCBAF5 mRNA的表达无明显线性相关性（P>0.05），在NNEDV组织内PCBAF5 mRNA 的表达之间为中度正相关的关系（R=0.501，P<0.05）（图

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本文编号：2731737