Dicerandrol B通过内质网应激—线粒体损伤诱导人宫颈癌细胞凋亡的机制

发布时间：2020-06-30 09:12

【摘要】：目的:从来源于植物内生真菌Phomopsis的六种化合物中筛选出具有抗肿瘤活性的天然化合物Dicerandrol B,以人宫颈癌HeLa细胞为研究对象,从内质网应激--线粒体损伤途径诱导细胞凋亡角度探讨Dicerandrol B抑制HeLa细胞增殖的作用机制,为开发新型天然抗肿瘤药物提供理论依据。方法:1.MTT方法检测来源于内生真菌Phomopsis中六种化合物HX03、HX05、HX06、TPB3、HTT46和TPBR1在不同时间、不同剂量下对人宫颈癌HeLa细胞和人胃癌MGC803细胞的增殖抑制能力,并选取人乳腺上皮细胞MCF10A做为良性对照细胞,从六种化合物中筛选出最佳抗肿瘤活性的化合物HX06,即Dicerandrol B。2.PI单染法流式细胞仪检测经Dicerandrol B作用后的HeLa细胞的细胞周期分布。实时荧光定量PCR检测细胞周期相关基因MKi-67和泛素结合酶E2S(UBE2S)的基因水平,以确定Dicerandrol B是否影响HeLa细胞周期。3.Annexin V-FITC/PI染色法流式细胞仪检测经Dicerandrol B作用后的HeLa细胞发生凋亡的细胞百分比,用Western blot检测与细胞凋亡相关的蛋白质cleaved-PARP的表达水平,验证Dicerandrol B是否引起HeLa细胞发生凋亡。4.Western Blot方法检测Dicerandrol B作用后HeLa细胞中与内质网应激相关蛋白质Grp78和泛素化蛋白的表达水平,判断Dicerandrol B诱导HeLa细胞凋亡的原因是否通过内质网应激。5.荧光染色方法用活性氧敏感荧光探针DCFH-DA并联合应用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC),检测细胞内ROS水平。同时,用MTT检测细胞生存率,明确NAC联合Dicerandrol B是否可以上调细胞生存率。6.Western Blot和实时定量PCR方法分析Dicerandrol B处理HeLa细胞6h细胞中p62蛋白,Keapl蛋白,细胞核Nrf2蛋白,p62基因,Nrf2基因,GPX1基因的变化以及Dicerandrol B处理HeLa细胞24h细胞核Nrf2蛋白,GPX1基因的改变,分析Dicerandrol B对HeLa细胞p62-Keapl-Nrf2信号通路的影响。7.Western Blot检测与线粒体损伤相关蛋白质Bcl-2、Bax、CytC的表达水平,判断Bax/Bcl-2比率的变化,以确定Dicerandrol B是否通过线粒体损伤途径诱导HeLa细胞凋亡。结果:1.与其他五种化合物(HX03,HX05,TPB3,HTT46和TPBR1)相比,Dicerandrol B(HX06)具有较强的抗肿瘤活性且对人良性乳腺上皮细胞增殖抑制能力较弱。用Dicerandrol B处理HeLa细胞24h,48h和96h,其ICso值分别为 7.13μg/mL,3.00μg/mL 和 1.84μg/mL,Dicerandrol B 抑制 HeLa 细胞的增殖呈现剂量依赖性和时间依赖性。2.流式结果显示Dicerandrol B处理HeLa细胞24h与对照组相比,3μg/mL组G2/M期HeLa细胞数量增加67.24%,S期HeLa细胞数量下降17.91%;5μg/mL组G2/M期HeLa细胞数量增加71.27%,S期HeLa细胞数量下降29.08%。实时荧光定量PCR结果显示Dicerandrol B诱导HeLa细胞中细胞周期相关基因MKi-67基因表达上调,UBE2S基因表达降低。这些数据说明,HeLa细胞在Dicerandrol B的作用下发生了细胞周期G2/M期阻滞。3.流式结果显示Dicerandrol B处理HeLa细胞24h,3μg/mL组凋亡细胞百分比为30.9%,5μg/mL组凋亡细胞百分比为45%,与对照组相比,差异有统计学意义(p0.01)。同时Dicerandrol B引起HeLa细胞中cleaved-PARP的水平上调,说明HeLa细胞在Dicerandrol B的作用下发生了细胞凋亡。4.Western Blot结果显示,Dicerandrol B处理HeLa细胞12h,细胞中内质网应激相关蛋白Grp78和Ub的水平增加,这表明HeLa细胞在DicerandrolB作用下发生了内质网应激。5.Dicerandrol B处理HeLa细胞24h,与对照组相比,HeLa细胞中ROS水平明显增加,联合应用NAC后,ROS水平降低。MTT结果显示,Dicerandrol B联合NAC后,细胞生存率较未应用NAC提高,说明Dicerandrol B引起HeLa细胞产生ROS。6.Western Blot和实时荧光定量PCR结果显示,Dicerandrol B处理HeLa细胞6h,HeLa细胞中p62和Keap1蛋白水平减低,细胞核内Nrf2蛋白水平增加,Nrf2基因和GPX1基因表达增多,说明HeLa细胞在Dicerandrol B作用下为了对抗氧化应激激活了 p62-Keap1-Nrf2信号通路,并引起下游抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶GPX1基因的表达增高。Dicerandrol B处理HeLa细胞24h细胞核内Nrf2蛋白水平减少,GPX1基因表达也下降,说明Dicerandrol B作用时间延长,p62-Keapl-Nrf2信号通路活化程度减弱。7.Western Blot 结果显示,Dicerandrol B 处理 HeLa 细胞 24h 细胞中 Bax/Bcl-2比率显著增加,细胞浆中细胞色素C蛋白水平上调。这表明HeLa细胞在Dicerandrol B作用下,线粒体损伤,细胞色素C释放,Dicerandrol B诱导HeLa细胞发生线粒体损伤途径介导的细胞凋亡。结论及创新点:1.从内生真菌Phomopsis代谢产物中筛选到具有较强抑制HeLa细胞增殖能力的 Dicerandrol B。2.明确了 Dicerandrol B抑制HeLa细胞增殖的机制,一方面是引起HeLa细胞的细胞周期阻滞G2/M期;另一方面是诱导HeLa细胞发生了内质网应激—线粒体损伤介导的细胞凋亡。3.明确了 Dicerandrol B作用下p62-Keapl-Nrf2信号通路的调节情况。本研究对Dicerandrol B抑制人宫颈癌HeLa增殖的机制进行探讨即本论文的创新所在。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33
【图文】：

处理人胃癌ＭＧＣ８０３细胞２４ｈ，引起人胃癌ＭＧＣ８０３细胞增殖率下降，这表明六逡逑种化合物均具有抑制ＨｅＬａ细胞和ＭＧＣ８０３细胞增殖的能力（／Ｋ０．０１）。不同浓逡逑度化合物作用下，ＨｅＬａ细胞的增殖率见图４．１，胃癌ＭＧＣ８０３细胞的增殖率见逡逑图邋４．２。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑１２０逦＿＿—ＨＸ０３邋２４ｈ逦ｌｉ０邋＇逦—ＨＸ０５邋２４ｈ逡逑２邋１００邋１逦－邋■－邋ＨＸ０３邋９Ｇｈ逦２１００邋Ｊｊ邋ｉ邋－邋？－邋ＨＸ０５邋９６ｈ逡逑｜逦８０－逦｜逦８０邋■逡逑＆逦６０邋■逦Ｓ．逦６０邋■逡逑＝逦＼邋ｆ逦ｉ邋－逡逑Ｉ邋４０邋，逦、＼逦Ｉ邋４０邋．逦、、逡逑ｓ邋１０邋■逦＼逦３邋２０邋？逡逑０逦．逦ｕ逦＾逦？逦０逦■逦？逦ｉ逦ｉ邋逦邋ｉ邋１１邋ｉ逡逑0邋１逦２逦４逦８逦１６逦０１２４８逦１６逡逑ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｎｇ／ｍＬ）逦ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｎｇ／ｍｌ）逡逑Ｃ逦Ｄ逡逑１２０邋ｉ逦ＴＰＢ３邋２４ｈ逦１２０逦—？—ＨＴＴ４Ｇ邋２４ｈ逡逑■0邋ｉ00邋，逦一邋＊－邋ＴＰＢ３邋９６ｈ逦２邋ｌ00邋？邋＾＾邋＾＿逦一邋卜邋ＨＴＴ４６邋９６ｈ逡逑Ｉ－逦卜逡逑１邋４０邋■逦＇ＳＮ逦ｉ邋４０．逡逑

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本文编号：2735146