【摘要】：目的:近年来研究发现,卵巢癌严重威胁着女性的健康,是目前最为棘手的妇科恶性肿瘤之一,其死亡率逐年上升,成为许多女性患者的巨大困扰。研究发现,卵巢癌出现治疗效果不理想、患者预后不良、死亡率高的主要原因是化疗过程中容易出现耐药性。沿着这个思路,进而发现了肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs),CSCs是存在于肿瘤细胞中的具有强自我更新、无限增殖及分化潜能的一小群特殊细胞,是肿瘤发生、转移和耐药复发的根源。因此,靶向卵巢癌干细胞(Ovarian cancer stem cells,OCSCs),为卵巢癌耐药机制的研究提供了方向,对于提高卵巢癌治疗效果具有重大意义。本文首先从CSCs生长的环境方面入手,发现其生存的环境主要是低氧龛(niche)微环境,在这种低氧的环境保护下,使CSCs很难接触到化疗药,进而也就提高了它们的逃逸能力,这便是CSCs发生耐药的机制。我们还发现低氧条件下有一类广泛存在于哺乳动物体内的重要转录因子——低氧诱导因子(hypoxia inducible factors,HIFs),HIFs两个具有生物活性的功能亚基是HIF-1α和HIF-2α。两者虽然具有高度同源性的结构,但是在低氧时激活的转录因子、组织表达类型以及介导的生物学功能等方面却具有特异性。同时有报道称,HIF-1α和HIF-2α与干细胞干性调节有关,尤其是HIF-2α,但目前关于HIF-2α对OCSCs干性及耐药性的研究甚少,且其具体作用机制并不清楚,因此,本文重点研究HIF-2α对OCSCs干性及耐药性的调节机制。研究方法:采用无血清非粘附悬浮培养OVCAR-3和CAOV-3卵巢癌细胞诱导卵巢癌球囊细胞。通过CCK-8 assay检测具有OCSCs样特性的OVCAR-3S和CAOV-3S卵巢癌球囊细胞对不同浓度的阿霉素adriamycin(ADR)、米托蒽醌mitoxantrone(MX)、紫杉醇paclitaxel(PTX)、依托泊苷etoposide(VP-16)及顺铂Cisplatin(DDP)中的药物敏感性变化;Western Blot检测了OVCAR-3S和CAOV-3S与其亲本细胞BCRP蛋白的表达水平。通过TCGA数据库分析379例卵巢癌HIF-2α与BCRP的mRNA表达相关性,通过免疫组化检测课题组115例卵巢癌组织这两种蛋白的表达并分析相关性;慢病毒转染及筛选构建HIF-2α过表达的OVCAR-3和CAOV-3稳转卵巢癌细胞株,及HIF-2α沉默的OVCAR-3 S和CAOV-3 S的稳转株细胞,分别通过qRT-PCR和Western Blot检测HIF-2α、BCRP表达。质谱和流式检测细胞对阿霉素的外排能力,考察干扰HIF-2α对卵巢癌干细胞药物敏感性的影响。基因序列分析BCRP gene启动子上游2kb区内与HIF-2α结合的HRE元件,荧光素酶报告基因分析及chip实验检测HIF-2α通过HRE元件与BCRP的结合作用;qRT-PCR检测干扰HIF-2α后BCRP水平的变化。通过裸鼠皮下接种稳转HIF-2α沉默慢病毒的OVCAR-3 MS细胞,构建HIF-2α沉默的裸鼠移植瘤模型,考察HIF-2α沉默对裸鼠移植瘤生长及对ADR药物敏感性的影响;应用qRT-PCR检测各组移植瘤组织HIF-2α及BCRP的mRNA表达情况,免疫组化及Western Blot检测各组移植瘤组织HIF-2α及BCRP的蛋白表达情况;质谱检测沉默HIF-2α的荷瘤鼠瘤组织内ADR含量的变化。结果:1,OVCAR-3 S和CAOV-3 S细胞与其亲本OVCAR-3和CAOV-3细胞比,ADR、MX、PTX、VP-16及DDP的IC_(50)值明显增高,即对这些化疗药具有明显的抗药性;其中,OVCAR-3 S和CAOV-3 S对ADR的抗药性最强,IC_(50)值分别是OVCAR-3细胞和CAOV-3细胞的(耐药指数RI)103.6、24.7倍。在OVCAR-3 S和CAOV-3 S中,BCRP的蛋白表达量分别是亲本细胞OVCAR-3和CAOV-3细胞的3.61倍和3.35倍。2,通过TCGA数据库分析,发现:卵巢癌患者的HIF-2α和BCRP的mRNA的表达明显的正相关;免疫组化检测并分析发现卵巢癌患者病理组织的HIF-2α与BCRP蛋白表达显著正相关;慢病毒转染shRNA-HIF-2α质粒,可沉默OVCAR-3MS和CAOV-3 MS细胞HIF-2α的表达,与sh-NC组比,转染sh-HIF-2α的OVCAR-3 S和CAOV-3 S细胞BCRP的蛋白表达水平均显著降低;流式检测发现细胞内的平均荧光强度(MFI)明显增多,即ADR药物蓄积明显增多;质谱分析发现细胞内ADR含量明显增多,即对ADR的外排能力降低。与NC-cDNA转染组比,转染HIF-2α-cDNA慢病毒的OVCAR-3和CAOV-3细胞中BCRP的蛋白表达水平均明显升高;流式检测发现细胞内平均荧光强度(MFI)明显降低,即ADR药物蓄积明显减少;质谱分析发现细胞内ADR明显减少,即对ADR的外排能力增加。3,基因序列分析发现BCRP gene启动子上游2kb区内-483到-478区存在一个可与HIF-2α结合的HRE元件CACGTG;共转染HIF-2α-cDNA和BCRP启动子野生型报告基因质粒的293T细胞及OVCAR-3细胞酶活性明显升高,而共转染BCRP启动子突变型报告基因质粒的细胞酶活性无明显变化;转染HIF-2α-cDNA慢病毒的OVCAR-3细胞与NC-cDNA转染组比,BCRP的mRNA表达水平均明显升高;转染sh-HIF-2α慢病毒的OVCAR-3 MS和CAOV-3 MS细胞与sh-NC组比,BCRP的mRNA表达水平均显著降低。结论:1,无血清非粘附悬浮培养的OVCAR-3 S和CAOV-3 S对ADR等化疗耐药。2,HIF-2α介导OCSCs耐药且与调控BCRP的表达及功能有关。3,在卵巢癌细胞中HIF-2α可与BCRP gene启动子区的HRE元件结合,对BCRP发挥直接的转录激活作用。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31
【图文】：
图 2.1 蛋白质含量测定标准曲线白样品处理据蛋白定量计算出的蛋白浓度，用 PBS 及上样缓冲液进行配每个孔道中，相同的样品体积均含有相同质量的蛋白，本实其中含有 100μg 蛋白。配好的样品置于金属浴中，保证样品在 100℃温度下至少 10m性的目的，变性后的样品即可进行后续实验。S-PAGE 凝胶电泳玻璃板用洗涤剂吸净，并用去离子水冲洗，置于玻璃板架上晾照“外高内低”的原则，将玻璃板安装在制胶架上，并用去装置不漏后，再进行灌胶。据所跑蛋白样品的分子量大小，配置不同浓度的分离胶；移液枪，将配置好的分离胶灌注到刚刚装好的玻璃板的缝隙
中国医科大学硕士学位论文16图 2.2 细胞质谱标准曲线图2.2.11.3 裸鼠移植瘤实验（1）瘤体处理种瘤 13 天后，每隔一天腹腔注射 ADR(1.5mg/Kg)，于第 30 天取瘤，称重，每个瘤取 0.2g，匀浆机破碎组织，反复冻融裂解细胞 3 次，用于样品处理。（2）瘤标准曲线取空白瘤体约 0.6g，匀浆机破碎组织，反复冻融裂解 3 次，按重量平均分成 6 份
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