子痫前期相关hsa-miR-18b-5p靶基因的分析验证

发布时间：2017-03-29 04:17

  本文关键词：子痫前期相关hsa-miR-18b-5p靶基因的分析验证，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：子痫前期(preeclampsia,PE)是妊娠期常见特发疾病,主要在妊娠20周以后出现高血压、蛋白尿为主的临床症状,在疾病的早期就可发生全身多器官系统的功能障碍,是导致孕产妇和围生儿病死率的重要原因之一[1]。目前PE的病因和病理机制尚未阐明,没有有效的预防和治疗方法,只能对症治疗或者终止妊娠控制病情发展,该疾病是妊娠合并症中疑难解决的问题之一[2]。但从PE的临床转归来看,患者终止妊娠后各临床症状迅即得以缓解,表明PE是胎盘相关性疾病[9]。近年来研究表明,子痫前期胎盘组织中存在差异性表达的微小RNA(micro RNA,mi RNA),它在基因表达调控中发挥着重要作用,PE的发生发展可能与这些差异性表达mi RNA密切相关[3-8]。我们实验室前期研究发现mi RNA-18b在PE患者的胎盘组织中是呈病理性低表达的[10],并初步检测了mi RNA-18b在滋养细胞中的功能[25],但未深入查找mi RNA-18b的靶分子。众所周知,mi RNA是通过对其靶分子的基因沉默作用发挥生物学作用的[37],我们通过靶基因分析初步预测了mi R-18b的靶基因为低氧诱导因子1α(HIF-1α),Karamjit等人在对高原牦牛的HIF-1α基因克隆研究中也提到HIF-1α被预测是人类mi R-18b的靶基因[11],但未通过实验证实。有研究表明HIF-1α在子痫前期的胎盘组织中是过表达的[12],这与mi RNA对其相关靶基因特有的基因沉默调控趋势是相符的,由此我们推测mi R-18b可能通过调控其靶基因HIF-1α的表达从而参与了子痫前期的发生发展过程。本实验拟深入研究两者的靶向关系,以便为子痫前期的预防和治疗提供新的方向。目的1.应用生物信息学方法并结合相关文献初步预测PE相关的mi R-18b-5p的靶基因为HIF-1α,同时在人绒毛膜滋养细胞层细胞(HTR-8/SVneo)模型中验证HIF-1α的表达。2.通过荧光素酶报告载体实验进一步验证mi R-18b-5p与其靶基因HIF-1α的基因调控作用,揭示mi R-18b-5p在PE发生过程中的病理作用。方法1.应用靶基因预测软件Target Scan、mi RBase等六种方法初步验证mi R-18b-5p与靶基因HIF-1α的靶向调控关系。2.采用逆转录-聚合酶链反应技术(Reverse transcriptase polymerase chain reaction RT-PCR)检测HTR-8/SVneo细胞系中HIF-1α的表达情况。3.应用mi RNA的过表达与抑制技术,在HTR-8/SVneo细胞中过表达与抑制mi R-18b-5p后,采用实时荧光定量PCR技术(quantificational real-time polymerase chain reaction real-time PCR)和免疫印迹(Western-blot)技术分别在m RNA水平和蛋白水平验证mi R-18b-5p与HIF-1α的靶向调控关系。4.采用荧光素酶报告基因法,对PE相关的mi R-18b-5p与其靶基因HIF-1α进行靶点验证,进一步明确mi R-18b-5p与HIF-1α的负性靶向调控关系。结果1.通过Target Scan等六种靶基因软件预测技术并取其中四种方法的交集,结果表明mi R-18b-5p与HIF-1α存在靶向调控。2.RT-PCR技术结果表明HTR-8/SVneo细胞系中有HIF-1α的表达。3.在HTR-8/SVneo细胞中过表达与抑制mi R-18b-5p后,real-time PCR结果显示转染mi R-18b-5p mimics的HTR-8细胞中mi R-18b-5p的表达量与对照组相比显著上升,与对照组相比,转染mimics后的细胞中HIF-1αm RNA表达水平显著下降,差异具有统计学意义(P0.05);转染mi R-18b-5p inhibitor的HTR-8细胞中mi R-18b-5p的表达量与对照组相比显著下降,差异具有统计学意义(P0.05),转染inhibitor后的细胞中HIF-1αm RNA表达水平与对照组相比上升不明显,差异无统计学意义(P0.05)。Western-blot结果显示在细胞中过表达mi R-18b-5p后HIF-1α在蛋白水平是显著降低的,差异具有统计学意义(P0.05);在细胞中降调节mi R-18b-5p后HIF-1α在蛋白水平是增高不显著,差异无统计学意义(P0.05)。表明mi R-18b-5p与HIF-1α存在负性调控关系。4.双荧光素酶报告基因法结果显示:野生型HIF-1α与mi R-18b-5p mimics共转染组的荧光素酶活性与对照组相比下降了25%,差异具有统计学意义(P0.05);突变型HIF-1α与mi R-18b-5p mimics共转染组与对照组比较差异不明显,差异无统计学意义(P0.05)。结论1.通过靶基因预测软件分析结果显示:mi R-18b-5p与HIF-1α之间存在靶向调控位点并通过实验验证人绒毛膜滋养细胞层细胞(HTR-8/SVneo)中有HIF-1α的基础表达,这为在HTR-8/SVneo细胞中研究mi R-18b-5p与HIF-1α的靶向关系提供了细胞模型研究的基础。2.载体实验验证结果显示,mi R-18b-5p与HIF-1α在m RNA水平和蛋白水平均存在负性靶向调控作用。在VEGF信号通路中,mi R-18b-5p可能通过调控靶基因HIF-1ɑ参与了PE发生的基因调控过程,这为阐明PE的病理机制奠定了一定的理论和实验基础。
【关键词】：子痫前期 微小RNA 胎盘 低氧诱导因子1α
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.244
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-13
• 文献回顾13-21
• 1 微小RNA的研究进展13-16
• 2 子痫前期16-18
• 3 miRNA与PE相关性的发现18-19
• 4 HIF-1α与PE相关性的研究进展19-21
• 实验一 hsa-miR-18b-5p靶基因的预测、筛选和低氧诱导因子HIF-1α在人绒毛膜滋养细胞系HTR-8／SVneo中的表达21-35
• 1 材料21-28
• 2 方法28-31
• 3 结果31-33
• 4 讨论33-35
• 实验二 hsa-miR-18b-5p靶基因的验证35-64
• 1 材料35-36
• 2 方法36-51
• 3 结果51-62
• 4 讨论62-64
• 小结64-65
• 参考文献65-74
• 个人简历和研究成果74-75
• 致谢75-76

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本文编号：273688