卵丘细胞在未成熟卵母细胞玻璃化冷冻中的作用及其机制研究

发布时间：2020-07-02 19:01

【摘要】：背景自1978年第一例试管婴儿Louise Brown在英国成功诞生以来,辅助生殖技术(Assisted reproductive technology,ART)迅速在世界范围内传播开来。1988年3月我国首例试管婴儿于北医三院诞生。据不完全统计,目前全球约有500余万名试管婴儿诞生~([1])。三十年来,辅助生殖技术得到了迅猛发展,目前的辅助生殖技术及其衍生技术包括:人工授精、体外受精与胚胎移植技术(IVF-ET)、卵胞浆内单精子显微注射技术(Intracytoplasmic Sperm Injection,ICSI)、胚胎植入前遗传学诊断技术(Preimplantation Genetic Diagnosis,PGD)、线粒体移植、未成熟卵体外成熟技术(In vitro maturation,IVM)、胚胎冷冻复苏技术、卵母细胞与卵巢组织冷冻技术、人工辅助孵出等。近年来随着女性生育年龄的推迟及卵巢癌、乳腺癌等疾病的影响,女性生育力保存得到了广泛的关注。目前卵母细胞玻璃化冷冻结合IVM培养技术在保存女性生育力方面取得了可喜成果,尽管如此,这些技术的安全性和可靠性仍有待进一步评估。卵丘细胞是包裹在卵母细胞外层的颗粒细胞,通过提供卵母细胞发育过程中必须的营养物质、信号分子和代谢产物调控卵泡发育,对卵母细胞成熟尤其是细胞核和胞质成熟有促进作用。之前的研究表明通过液相色谱质谱法检测卵丘细胞中蛋白组学发现可发育为囊胚组和非囊胚组蛋白表达存在差异~([2])。这些差异蛋白不仅参与卵泡发育,还可能参与部分免疫反应,在胚胎植入过程中起一定的作用~([3]),此外,卵丘细胞还可吸引、捕获甚至筛选精子、触发精子获能、顶体反应并防止透明带僵化~([4;5])。此外,人卵丘细胞还可产生胰岛素样生长因子Ⅱ(Insulin-like growth factor,IGF-Ⅱ),其与卵泡的发育、优势卵泡的选择及卵母细胞的成熟有着密切的联系~([6])。目前关于卵丘细胞对卵母细胞冷冻过程中的作用研究较少,Jin等人的研究表明卵丘细胞可显著增强成熟卵母细胞冻存后的存活率、卵裂率、优质胚胎率、着床率和临床妊娠率~([7])。然而,Minasi等人报告玻璃化冷冻解冻后卵丘细胞-卵母细胞复合物和裸卵的存活率无明显差异~([8])。国内李娜等人的研究显示卵丘细胞保留与否不影响玻璃化冻融后卵母细胞的存活率,但带有卵丘细胞的卵母细胞体外成熟率明显高于裸卵~([9])。玻璃化冷冻对未成熟卵母细胞冷冻的影响的研究较匮乏。对牛GV期卵母细胞冷冻的研究显示,相比新鲜对照组,冻融后卵母细胞内某些第二信使环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)及成熟促进因子(Maturation promoting factor,MPF)含量下降,导致体外成熟过程中GV期卵母细胞成熟率降低,可能因玻璃化冷冻过程中细胞膜损伤、胞质流失导致~([10])。卵丘细胞对未成熟卵母细胞玻璃化冷冻后发育潜能的影响仍有待进一步评估,同时关于冷冻复苏过程对卵母细胞损伤的机制需要更为深入的研究。本研究以小鼠和人类未成熟卵母细胞为研究对象,系统研究玻璃化冷冻时卵丘细胞存在与否及冷冻时期对小鼠未成熟卵母细胞解冻存活率、体外成熟率、受精率及后续胚胎发育潜能的影响。以人类未成熟卵母细胞为研究对象,研究玻璃化冷冻时卵丘细胞存在与否及冷冻时期对未成熟卵母细胞纺锤体和染色体的影响。采用高通量测序技术研究玻璃化冷冻对未成熟卵母细胞全基因组表达谱的影响,旨在寻找未成熟卵母细胞冷冻的最佳时期和冷冻保存方案,为女性生育力保存提供理论依据。第一部分卵丘细胞对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻后发育的影响研究目的1.探讨有无卵丘细胞在玻璃化冷冻过程中对小鼠未成熟卵母细胞受精及胚胎发育的影响。2.探讨未成熟卵母细胞冷冻应先进行体外成熟再冷冻还是先冷冻再进行体外成熟。材料与方法收集小鼠未成熟卵母细胞,将其分为五组:组1:卵丘细胞-卵母细胞复合物(COC)体外成熟后冷冻;2:裸卵(DO)体外成熟后冷冻;组3:裸卵(DO)体外成熟;组4:卵丘细胞-卵母细胞复合物(COC)冷冻后体外成熟;组5:裸卵(DO)冷冻后体外成熟。以组3为对照组;将五组体外培养后得到成熟卵母细胞用同种属雄鼠精子进行体外受精并培养至囊胚期。观察比较五组的解冻存活率、成熟率、受精率、卵裂率、囊胚形成率等,并进行数据统计分析。结果1.DO体外成熟组相比其他四组,其MII率、解冻存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率均较高,差异有统计学意义(P0.05)。2.COC体外成熟后冷冻组的MII率(72.33%VS60.39%)、解冻存活率(79.13%VS52.46%)均高于DO体外成熟后冷冻组(P0.05),受精率(53.85%VS46.88%)、卵裂率(61.22%VS60.00%)、囊胚形成率(14.29%VS3.33%)两组间虽无统计学差异,但COC体外成熟后冷冻组仍有高于DO体外成熟后冷冻组的趋势。3.DO冷冻后体外成熟组与COC冷冻后体外成熟组相比,其MII率(45.57%VS62.50%)、解冻存活率(48.47%VS68.38%)均较低,差异有统计学意义(P0.05)。4.COC体外成熟后冷冻组的MII率(72.33%VS62.50%)、解冻存活率(79.13%VS68.38%)、受精率(53.85%VS64.00%)囊胚形成率(14.29%VS25.00%)与COC冷冻后体外成熟组无明显差异(P0.05)。5.DO体外成熟后冷冻组的解冻存活率(52.46%VS48.47%,P0.05)高于DO冷冻后体外成熟组,但囊胚形成率(3.33%)低于DO冷冻后体外成熟组(12.00%)和DO直接体外成熟组(26.98%),差异有统计学意义。结论1.裸化未成熟卵母细胞先行体外成熟培养后再冷冻,其成熟率优于先冷冻后体外成熟,与未冷冻卵母细胞相比,冷冻过程明显降低卵母细胞随后胚胎发育潜能。2.无论在卵母细胞先行体外成熟培养后冷冻或先冷冻后体外成熟培养,卵丘细胞对卵母细胞冷冻均有保护作用,有利于提高其随后的受精、胚胎继续发育潜能。第二部分卵丘细胞在玻璃化冷冻过程中对人类未成熟卵母细胞纺锤体及染色体的影响研究目的通过比较有无卵丘细胞在人类未成熟卵母细胞玻璃化冷冻后的纺锤体和染色体分布情况,探讨卵丘细胞对未成熟卵母细胞玻璃化冷冻的过程中纺锤体及染色体的影响。材料与方法收集我中心行ICSI患者的未成熟卵母细胞,将人类未成熟卵母细胞分为先冷冻再IVM组和先IVM再冷冻组,再将两组根据有无卵丘细胞分为裸卵(DO)、卵丘细胞-卵母细胞复合物(COC)组,以新鲜裸卵直接在体外行IVM为对照,将五组卵母细胞玻璃化冻融后进行纺锤体和染色体免疫荧光染色,统计五组纺锤体及染色体正常形态率。结果1.与先冷冻再IVM DO组相比,先冷冻再IVM COC组纺锤体(60.00%VS11.76%)及染色体(45.00%%VS11.76%)正常率明显增高;2.与新鲜DO组相比,先冷冻再IVM DO组纺锤体(78.26%VS11.76%)及染色体(65.22%VS11.76%)正常率明显降低;而先IVM再冷冻DO组纺锤体(55.56%VS78.26%)和染色体(61.11%VS65.22%)正常率与新鲜DO组无统计学差异。3.与先IVM再冷冻COC组相比,先冷冻再IVM COC组纺锤体(85.71%VS60.00%)及染色体(66.67%VS45.00%)正常率无统计学差异。结论在DO未成熟卵母细胞中,先体外成熟后冷冻,对卵母细胞的纺锤体损伤较先冷冻再体外成熟培养要小,而有卵丘细胞包裹的卵母细胞,先体外成熟后冷冻还是先冷冻后体外成熟培养,纺锤体的形态均正常,卵丘细胞对未成熟卵母细胞的冷冻有保护作用,可以减缓冷冻保护剂渗透到卵母细胞的速度,减少冷冻保护剂的毒性作用。第三部分玻璃化冷冻/解冻对人未成熟卵母细胞全基因组表达的影响研究目的通过比较人类未成熟卵母细胞玻璃化冷冻后行体外成熟培养与直接体外成熟至成熟期的全基因组表达的差异,筛选影响卵母细胞冷冻的关键基因和相应的调控通路,探讨玻璃化冷冻对未成熟卵母细胞基因表达谱的影响。材料与方法收集于我中心行卵胞浆内单精子注射患者的废弃未成熟卵母细胞,部分直接行体外成熟培养,部分先进行玻璃化冷冻再行体外成熟培养,用全基因组表达谱芯片对两组成熟期卵母细胞冷冻后基因表达谱进行分析。结果1.卵母细胞玻璃化冷冻后全基因组表达谱芯片分析中共获得2倍以上差异差异表达基因765个,其中上调基因103个,下调基因662个。2.细胞过程、代谢过程、生物调节、生物过程调节、对刺激的反应、细胞成分组织或生物发生、多细胞组织过程、定位、发育过程、信号、生物过程的积极调节、生物过程负调节、免疫系统过程等参与了冷冻后下调基因表达的生物过程调控;3.细胞、细胞器、细胞膜部分、膜封闭腔、大分子配合物、细胞外区部分等参与了冷冻后下调基因表达调控的细胞组成调控;结合、催化活性、分子功能的调整、转录活性的调节剂、转运蛋白活性、信号传导蛋白活性、分子传导蛋白活性、结构分子活性等参与冷冻后下调基因表达的分子功能调控。4.癌症通路、人类乳头瘤病毒感染通路、RNA代谢通路、Hippo信号通路、mtor信号通路、Wnt信号通路、调节干细胞多能性的信号通路、ECM受体相互作用通路参与了冷冻后基因的调控通路。结论与直接体外成熟的卵母细胞相比,在未成熟期玻璃化冷冻后体外成熟的卵母细胞存在多个差异表达基因,这些基因变化与卵母细胞质量、细胞器组成和多种调节通路有关。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714.8
【图文】：

示意图,卵母细胞,玻璃化冷冻,过程

图 2 卵母细胞玻璃化冷冻过程示意图.2 卵母细胞玻璃化解冻过程：解冻液1（WS1）1ml 放入37℃不通气的培养箱中平衡2h以上，3、4（WS2，WS3,WS4）各500ul在室温条件下平衡1 h；解冻时otop，迅速将载杆的帽拔掉，将载杆末端的塑料薄片插入预热的将卵母细胞移入WS2，3 min之后移入WS3中5 min，最后转入WS卵母细胞移入G-IVF Plus 培养液中放入培养箱中培养1-2h。WS1

示意图,卵母细胞,玻璃化,示意图

图 3 卵母细胞解冻过程示意图.3 精子的获取及常规体外受精1.3.3.1 首先，在实验前一下午将含有 G-IVF Plus 及 G-1 P放入培养箱(37℃，6％CO2)中过夜平衡。1.3.3.2 挑取一只性成熟体貌正常的雄性小鼠，断颈处死后取精管，放入 G-MOPS Plus 中清洗两次，并用 1ml 无菌注射器将输将输精管中精子挤出，轻轻晃动液体使精子分散。1.3.3.3 用 9 寸巴斯德吸管将 G-IVF Plus 液滴吸入盛有梯度将其倾斜放入培养箱，使精子上游 15-30min。1.3.3.4 将小白管中上层液体轻轻地吸出 3-4 mL，吸取适量原细胞的微滴中，可以看到卵母细胞被精子推着转动，说明精子1.3.3.5 体外受精 4-6 h 之后观察双原核及第二极体排出情况胚胎移入 G-1 Plus 卵裂培养液中培养，48 小时后观察胚胎情胎移入 G-2 Plus 囊胚培养液中继续行囊胚培养。

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