高雌激素暴露通过DNA甲基化修饰干扰人绒毛滋养细胞印记基因CDKN1C和IGF2的表达

发布时间：2020-07-06 07:11

【摘要】：研究背景和目的:控制性卵巢刺激(controlled ovarian stimulation,COS)是辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)获得一定数量卵母细胞的基础。但它也使母体在配子及早期胚胎发育阶段暴露于一个远高于生理的高雌激素环境。我们团队的前期研究发现,母体早期的高雌激素暴露可导致子代低出生体重及小于胎龄儿(small-for-gestational-age,SG A)的风险增加。但其具体机制目前尚不明确。雌激素暴露可通过受体后信号通路影响DNA甲基化等表观遗传修饰,干扰基因表达。胎盘中有许多与生长发育相关的印记基因,其表达受相应印记调控区DNA甲基化调节。我们的前期研究发现,ART子代胎盘中印记基因CDKN1 C及IGF2的mRN A表达显著上调,其相应印记调控区KvDMR1及H19DMR的DNA甲基化水平也发生显著改变,但这些改变是否与母体高雌激素暴露相关目前尚不明确。本研究比较经ART新鲜胚胎移植妊娠子代与自然妊娠子代的出生体重及其与母体取卵前HCG注射日血清雌激素(estradiol,E2)水平的相关性,探索母体高雌激素暴露对子代出生体重的影响。再以不同浓度的雌激素处理人绒毛滋养细胞系HTR8,研究雌激素对滋养细胞中CDKIN1C及IGF2表达的影响及其相应印记调控区KvDMRI及H19 DMR的DNA甲基化状态。探索高雌激素暴露与胎盘滋养细胞中生长发育相关印记基因表达改变的相关性,以期阐明ART所致高雌激素暴露影响子代出生体重的机制。研究方法:1.回顾性分析比较1023例经ART新鲜胚胎移植妊娠子代与1226例自然妊娠子代的出生体重,并按母体取卵前HCG注射日血清雌激素水平的中位数对两组子代的出生体重进行分层比较,探索母体高雌激素暴露对子代出生体重的影响。2.在体外以不同浓度的雌激素(0,10-9,10-7,10-5 mol/L)处理人绒毛滋养细胞系HTR8,模拟体内生理及超生理浓度雌激素对人绒毛滋养细胞的影响。3.应用实时逆转录 PCR 技术(Quantitative Real-time RT-PCR,RT-qPCR)研究不同浓度雌激素对滋养细胞中CDKN1C及IGF2表达的影响。4.用亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing,BSP)的方法研究目的基因相应印记调控区KvDMR1及H19 DMR的DNA甲基化状态。结果1.ART组与自然妊娠组出生体重比较及其与母体HCG注射日雌激素的相关性ART组子代平均出生体重低于自然妊娠组,但无显著性差异(P0.05)。但当我们根据HCG注射日母体血清雌二醇的中位数(9974pmol/L)将ART组分为高雌激素组(E29,974pmol/L)和低雌激素组(E2≤9,974pmol/L)时,高雌激素组子代的出生体重则显著低于低雌激素组及自然妊娠组(p0.05)。2.不同浓度雌激素处理对HTR8中CDKN1C及IGF2基因mRNA表达的影响用10-5 mol/L雌二醇处理24小时(h)或用≥10-9 mol/L雌二醇处理48h均能显著上调HTR8中CDKKN1C的mRNA表达水平(p0.01)。雌二醇处理24h并不改变HTR8中IGF2的mRNA表达水平,但10-5 mol/L雌二醇处理48h可显著上调HTR8中IGF2的mRNA表达水平(p0.05)。3.不同浓度雌激素处理对HTR8中目的基因相应印记调控区KvDMR1及H19 DMR DNA甲基化水平的影响。用10-5 mol/L雌二醇处理24 h或用≥10-7 mol/L雌二醇处理48h均能显著下调HTR8中KvDMR1的DNA甲基化水平(p0.01)。雌二醇处理24h并不改变HTR8中H19 DMR的DNA甲基化水平,但10-5 mol/L雌二醇处理48h可显著上调HTR8中H19 DMR的DNA甲基化水平(p0.05)。结论1.母体HCG注射日较高的雌二醇水平(E29,974pmol/L)可显著下调经新鲜胚胎移植妊娠子代的出生体重。2.超生理浓度的雌激素处理人绒毛滋养细胞HTR8可显著上调生长发育相关印记基因CDKN1C及IGF2的表达。并显著改变其相应印记调控区的DNA甲基化水平。3.结合前期研究结果“ART子代胎盘中CDKN1C及IGF2表达上调,其印记调控区的DNA甲基化状态也发生相应变化”,我们认为,ART所导致的胚胎高雌激素暴露通过人类绒毛滋养细胞中印记调控区的DNA甲基化干扰生长发育相关印记基因CDKN1C及IGF2的表达,从而影响子代出生体重。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.8
【图文】：

目的片段扩增后用融解曲线验证扩增产物的特异性，如果产物是特异性扩增，逡逑融解曲线就会出现一尖峰；如果有引物二聚体或非特异性扩增，就会出现多个尖逡逑峰（见图４．２）。逡逑１９逡逑

图４．２融解曲线逡逑用ＵＴ５ｍｏｌ／Ｌ雌二醇处理２４小时（ｈ）或用￥；１０＿９ｍｏｌ／Ｌ雌二醇处理４８ｈ均能显逡逑著上调ＨＴＲ８中ＣＤ尺Ａ７Ｃ的ｍＲＮＡ表达水平（ｐ＜０．０１）（见图４．３）。雌二醇处理逡逑２４ｈ并不改变ＨＴＲ８中／ＧＦ２的ｍＲＮＡ表达水平，但ｌ（Ｔ５ｍｏｌ／Ｌ雌二醇处理４８ｈ可逡逑显著上调ＨＴＲ８中／ＧＦ２的ｍＲＮＡ表达水平（ｐ＜０．０５）（见图４．４）。逡逑２０逡逑

图４．３不同浓度（０，丨０—９，邋１邋（Ｔ７，邋１邋（Ｔ５邋ｍｏｌ／Ｌ）雌激素分别处理２４ｈ及４８ｈ对ＨＴＲ８中逡逑ＣＸ＾ＷＣｍＲＮＡ表达的影响（结果用均数±标准误表示；＊＊／？＜０．０１与处理２４ｈ空白逡逑

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本文编号：2743321