miR-136-3p在多囊卵巢综合征大鼠胰岛素抵抗发病机制的研究

发布时间：2020-07-10 07:30

【摘要】：目的多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育龄期女性常见的生殖内分泌疾病,常伴有代谢障碍,近80%的PCOS患者合并有不同程度的胰岛素抵抗(polycystic ovary syndrome with insulin resistance,PCOS-IR)。本课题组采用高通量基因测序技术,筛选出SD雌性大鼠PCOS-IR模型较相应的对照组模型卵巢组织特异性高表达的miR-136-3p,预测其潜在靶基因胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1),并初步阐明miR-136-3p通过调控IRS-1调控其下游磷脂酰肌酐-3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)通路的机制。我们将miR-136-3p转染至人卵巢颗粒细胞瘤细胞(kartogenin,KGN细胞)及人肾上皮细胞(293T细胞),为进一步研究miR-136-3p在细胞中调控IRS-1/PI3K/AKT信号通路参与PCOS-IR的分子机制奠定基础。方法(1)使用高通量基因测序技术,分析PCOS-IR组大鼠及对照组大鼠卵巢中差异微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)的表达谱,最后利用生物信息学方法筛选出PCOS-IR组特异性高表达的miRNAs及其生物预测潜在靶基因;(2)miR-136-3p的表达水平及其与IRS-1/PI3K/AKT通路的关系:1)使用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法分析两组大鼠卵巢组织中miR-136-3p、IRS-1 mRNA表达水平;2)采用Western blot方法分析两组大鼠卵巢组织中IRS-1、PI3K、AKT、磷酸化磷脂酰肌酐-3激酶(phosphorylated phosphoinositide 3-kinase,pPI3K)和磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,pAKT)的蛋白表达水平。(3)观察miR-136-3p及其不同浓度对KGN细胞及293T细胞的作用:将miR-136-3p模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)的转染试剂设计成不同的梯度浓度后,转染至KGN细胞及293T细胞内,观察增强或抑制miR-136-3p及不同浓度miR-136-3p在KGN细胞及293T细胞中对IRS-1 mRNA表达水平的影响及IRS-1、PI3K、AKT、pPI3K、pAKT蛋白表达水平的影响。(4)观察IRS-1/PI3K/AKT通路之间的蛋白相互作用:使用免疫共沉淀(co immunoprecipitation,COIP)磁珠法,检测IRS-1、pPI3K、pAKT蛋白之间的直接作用。结果(1)两组大鼠卵巢组织高通量基因测序结果显示:PCOS-IR组中的miR-136-3p明显高于对照组。我们使用生物信息学技术预测其生物预测靶基因为IRS-1,相关GO分析及KEGG分析显示其与PI3K/AKT通路密切相关。(2)RT-PCR实验显示:1)PCOS-IR组中的miR-136-3p mRNA表达水平明显高于对照组,IRS-1 mRNA表达水平明显低于对照组(P0.05);2)miR-136-3p mimic转染KGN细胞及293T细胞48 h后,IRS-1 mRNA表达水平均明显低于对照组(两组细胞P均0.05),inhibitor组结果相反。(3)Western blot结果显示:1)PCOS-IR组大鼠卵巢组织IRS-1、pPI3K、pAKT表达水平均明显低于对照组(P0.05);2)miR-136-3p mimic转染KGN细胞及293T细胞48 h后,IRS-1、pPI3K、pAkt的蛋白表达水平均明显低于对照组(两组细胞P均0.05),inhibitor组结果则相反;3)不同梯度浓度的miR-136-3p mimic转染KGN细胞及293T细胞48 h后,IRS-1、pPI3K、pAKT的蛋白表达水平均明显低于对照组,且随着梯度的增加,此三种基因的蛋白表达量均明显下降(两组细胞P均0.05),inhibitor组则升高。(4)COIP实验结果显示:IRS-1与pPI3K蛋白之间存在直接作用。结论(1)IRS-1/PI3K/AKT信号通路是miR-136-3p参与PCOS大鼠卵巢和颗粒细胞IR作用机制的途径之一。(2)IRS-1与pPI3K蛋白直接作用,与PI3K/AKT共同构成胰岛素分子信号转导通路。
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R711.75
【图文】：

聚类分析,生物信息学分析,硕士学位论文,医科大学

广州医科大学硕士学位论文结果1. PCOS-IR 大鼠卵巢组织的生物信息学分析1.1 miR-136-3p 在 PCOS-IR 大鼠卵巢中的表达水平为研究 miR-136-3p 在 PCOS-IR 组大鼠卵巢中的表达情况，我们利用两组大鼠（对照组与 PCOS-IR 组）的两对卵巢进行高通量基因测序及聚类分析，结果如图 1 所示。

靶基因,相关性

2. miR-136-3p 与靶基因的相关性。A). 在大鼠中，miR-136-3p 与 IRS-1 碱基序列比miR-136-3p 与 IRS-1 的部分核苷酸之间形成碱基互补，存在着结合区域；B). 红色显示 miR-136-3p 的序列在哺乳动物中高度保守，具有同源性。Figure 2. The correlation between miR-136-3p and its target gene. A). The alignment oR-136-3p with IRS-1 indicates that miR-136-3p forms a base complementation with a pcleotide of IRS-1, where a binding region exists; B). The red box shows that the miR-13are highly conserved and homologous in mammals. miR-136-3p 靶基因蛋白富集分析为了解 miR-136-3p 在 PCOS-IR 大鼠卵巢中发挥作用时可能参与的相关，我们采用了 KEGG 分析、GO 分析和构建靶基因 PPI 网络图对 miR-1关靶基因之间联系和蛋白富集情况进行研究。结果如图 3 所示。

miR-136-3p在多囊卵巢综合征大鼠胰岛素抵抗发病机制的研究

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【参考文献】