【摘要】：背景与目的多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期女性较常见一种生殖内分泌紊乱性疾病,临床症状主要为月经稀发或闭经,排卵异常,卵巢多囊样改变,高雄激素血症,肥胖以及胰岛素抵抗,并伴有较多远期并发症,如糖尿病,高血压,高血脂,心血管疾病等,严重危害女性的身心健康。目前,关于PCOS的发病机制尚不明确,研究表明PCOS的发病与遗传,环境,种族,生活方式以及慢性低度炎性反应均有关系,探索PCOS可能的发病机制并寻找一种治疗PCOS,延缓远期并发症的有效方法,已经成为目前生殖医学领域研究的热点。microRNA(miRNA)是一种短链非编码RNA,可在翻译前水平调控基因的表达。miRNA参与各种生命活动,调控细胞的增殖凋亡,其表达水平异常可造成机体生活活动的紊乱,导致癌症,免疫性,内分泌性等疾病的发生。研究表明,miRNA可能与胰岛素抵抗的发生,卵泡发育障碍,颗粒细胞增殖凋亡以及卵泡激素的合成有关,在PCOS的发生发展中发挥着一定的作用。近期,外泌体已经成为一个新的研究热点,关于外泌体的研究越来越多。外泌体是由细胞通过胞吞胞吐作用分泌的一种直径在30-100nm的膜性小囊泡,有脂质双层膜结构,镜下呈杯口状结构,内含miRNA,mRNA,lncRNA,脂质,蛋白质等多种生物活性物质,广泛分布于血清,血浆,卵泡液,腹水,唾液,尿液等多种体液中。外泌体作为一种新兴的细胞间沟通媒介,可以通过将蛋白质,miRNA,mRNA等分子物质传递到靶细胞中而在细胞通讯中发挥重要的作用。所以,目前关于外泌体源性miRNA作用的研究已经成为一个新的方向,探索外泌体源性miRNA在各种疾病发生发展中可能分子机制。本实验将从多囊卵巢综合征患者血清,卵泡液外泌体miRNA出发,通过高通量测序以及生物信息学分析,筛选出PCOS患者差异性表达的血清外泌体源性miRNA,为PCOS的诊断以及发病机制的研究提供一定的理论基础;同时筛选出PCOS患者差异性表达的卵泡液外泌体源性miRNAs及卵泡液特异性外泌体miRNAs,为探索PCOS患者胚胎质量下降、排卵异常的分子机制提供一定的基础。材料和方法选择于河南省人民医院生殖医学中心行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕的患者,根据鹿特丹标准诊断为PCOS的患者为实验组,因单纯输卵管因素不孕的患者为对照组,经河南省人民医院伦理委员会批准,患者签署知情同意书后,选择半年内未进行激素治疗的患者于月经第2-4天抽取外周血,同时收取入组患者取卵当日的外周血及第一管清亮无血液污染的卵泡液。将收取的标本3000 rpm离心20 min,取上清液,分装后冻于-80℃冰箱中备用。随后,利用Exoquick ~(TM)试剂盒提取血清及卵泡液中的外泌体,透射电子显微镜观测提取物的大小和形态,Western-Blot检测外泌体特异性蛋白标志物CD63和CD9的表达;采用试剂盒提取纯化外泌体miRNAs,高通量测序和生物信息学分析PCOS组和正常组血清及卵泡液外泌体中miRNAs的差异性表达,实时荧光定量聚合酶链反应技术(Real Time qPCR,qRT-PCR)对10种筛选出的miRNAs进行验证。采用SPSS22.0软件录入数据后进行t检验分析,实验数据中的计量资料以x±s(均数±标准差)表示,P0.05为两组间的差异有统计学意义。结果1.经透射电镜和Western-blot检测发现于血清和卵泡液中分离出的提取物符合文献中对外泌体形态及特征的描述;2.高通量测序及生物信息学分析结果显示:月经D2-4外周血血清外泌体样本中,PCOS组共有243条差异表达显著的miRNAs,其中表达上调115条,下调128条;q-PCR验证结果显示miR-146a-5p,25-5p,27a-3p,93-5p,23a-3p,223-5p,25-3p,483-5p,383-5p的表达水平在PCOS组显著升高(P0.05);而miR-141-3p的表达水平较正常组虽有下降,但组间差异无统计学意义(P0.05);3.PCOS卵泡液外泌体中差异表达倍数在2倍以上且两组均显示“Detected”的miRNAs共有68条,表达上调27条,下调41条,筛选10条进行qRT-PCR验证,结果显示10种miRNAs的表达水平在PCOS患者中均较对照组显著升高(P0.05);4.将卵泡液测序结果与取卵当天血样测序结果对比分析,发现仅在卵泡液中表达的差异性表达miRNAs,共有63条,其中表达上调30条,下调33条。结论1.与NON-PCOS相比,PCOS月经期血清中存在差异性表达miRNA,miR-146a-5p,93-5p,27a-3p,-23a,483-5p可能通过调控胰岛素信号通路及颗粒细胞的增殖凋亡参与PCOS的发生发展。2.PCOS卵泡液外泌体中miR-16-5p,15b,486-5p可能与PCOS患者排卵障碍以及PCOS胰岛素抵抗的形成有关。在PCOS中存在卵泡液特异性表达外泌体miRNA。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R711.75
【图文】：
结 果清及卵泡液中外泌体的特性分析透射电镜观察发现两组血清和卵泡液外泌体的形态及大小（图 1）为 30-250 nm 的圆形或椭圆形膜性囊泡，有双层膜性结构，可单个分群聚集分布，两组之间形态与大小无明显差异；SDS-PAGE 电泳后经染色剂染色后显示两组电泳结果中蛋白条带相似（图 2），Wester行 CD9，CD63 的鉴定，检测出两组患者血清和卵泡液外泌体中均有63 的表达，而细胞中无这两种蛋白（图 3，图 4）。
图 2 考马斯亮蓝染色检测血清外泌体蛋白成分 图 3 Western blot 检测外泌体标志分图 4 CD9，CD63 特异性蛋白分子在两组卵泡液外泌体中的表达2 PCOS 血清外泌体差异性表达 miRNAs 的生物信息学分析比对常见的 RNA 序列，检测出样品中的非编码 small RNA，通过与已知RNA 数据库比对鉴定小 RNA，分析出各类小 RNA 的所占比例，其中 miRN
图 2 考马斯亮蓝染色检测血清外泌体蛋白成分 图 3 Western blot 检测外泌体标志分图 4 CD9，CD63 特异性蛋白分子在两组卵泡液外泌体中的表达2 PCOS 血清外泌体差异性表达 miRNAs 的生物信息学分析比对常见的 RNA 序列，检测出样品中的非编码 small RNA，通过与已知RNA 数据库比对鉴定小 RNA，分析出各类小 RNA 的所占比例，其中 miRN
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本文编号：2752025
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