孕鼠羊水栓塞后C3a、MPO、NF-κB的变化及人羊膜间充质干细胞干预的实验研究

发布时间：2020-07-13 05:57

【摘要】：目的:培养hAMSCs至第4代,模拟人类羊水胎粪液进入母体循环建立SD孕鼠羊水栓塞模型,在注入羊水胎粪液前后经孕鼠腹腔静脉移植hAMSCs,研究补体C3a、MPO、NF-κB在AFE中的变化,探讨hAMSCs对孕鼠AFE的调节作用。方法:培养hAMSCs至第4代,FCM检测其表型及IHC检测波形蛋白表达情况,调整其浓度为1×10~5个/mL。40只健康SD孕鼠,随机分为对照组(NS组,n=10)、羊水胎粪组(MAF组,n=10)、实验组1(n=10)、实验组2(n=10),其中实验组1在建立羊水栓塞模型前30min移植hAMSCs,实验组2在注入羊水胎粪液后随即移植hAMSCs。取右肺组织进行HE染色,APM特染,IHC检测CK16表达情况,验证羊水栓塞模型是否成功。肺组织称量湿重及干重(W/D)。IHC检测各组右肺组织NF-κB、C3a的表达,Western-blot检测左肺NF-κB的相对含量,分光光度法测量左肺MPO的吸光度(A),ELISA检测血清C3a的含量。所有数据使用SPSS18.0统计分析,各组间进行方差齐性检验,方差齐采用单因素方差分析,方差不齐采用秩和检验,P0.05有统计学意义。结果:1.hAMSCs表型鉴定:流式细胞仪检测结果显示hAMSCs高表达CD34、CD90、CD105、CD73、CD45,几乎不表达CD11b、CD19和HLA-DR。2.临床表现:对照组未见明显异常;MAF组注入羊水胎粪液后呼吸浅快,心率先加快后逐渐减慢,期间出现局部抽搐、大小便失禁;实验组1移植hAMSCs,呼吸出现一过性加快,注入羊水胎粪液呼吸、心跳加快,而后呼吸变浅但频率未见明显改变,个别出现抽搐、大小便失禁;实验组2注入羊水胎粪液和移植hAMSCs后呼吸快,心率快,个别孕鼠出现抽搐、大小便失禁。3.鉴定AFE模型:HE染色见MAF组、实验组1、实验组2肺组织不同程度充血,且肺血管内见不定形物质存在,APM特染肺血管内见蓝染的羊水黏液成分及桃红色丝状物,IHC检测CK16显示肺血管内呈棕黄色絮状或丝状物表达。4.各组肺组织W/D:对照组(3.67±0.23)、MAF组(10.03±0.60)、实验组1(8.43±0.20)、实验组2(8.27±0.22),MAF组、实验组1、实验组2与对照组比较均有差异(P0.05),MAF组与实验组1、实验组2比较均有差异(P0.05)。5.C3a表达:IHC染色肺血管周围、肺支气管周围及肺组织间隙见棕黄色颗粒表达,对照组强阳性表达,MAF组弱阳性表达,实验组1、实验组2阳性表达。各组OD值:对照组(0.36±0.02)、MAF组(0.142±0.027)、实验组1(0.25±0.15)、实验组2(0.27±0.02)。ELISA检测C3a水平:对照组(27.23±1.06)、MAF组(16.47±1.13)、实验组1(21.61±0.72)、实验组2(22.52±0.83)。MAF组、实验组1、实验组2与对照组比较均有差异(P0.05),MAF组与实验组1、实验组2比较均有差异(P0.05)。6.NF-κB表达:IHC染色肺血管及肺支气管周围见棕黄色颗粒,对照组弱阳性表达,MAF组强阳性表达,实验组1、实验组2阳性表达。各组OD值:对照组、(0.14±0.02)MAF组(0.39±0.05)、实验组1(0.27±0.02)、实验组2(0.25±0.03)。Western blot检测NF-κB:对照组(0.09±0.04)、MAF组(0.44±0.08)、实验组1(0.15±0.03)、实验组2(0.12±0.04)。MAF组、实验组1、实验组2与对照组比较均有差异(P0.05),MAF组与实验组1、实验组2比较均有差异(P0.05)。7.分光光度法检测MPO活力:对照组(1.22±0.13)、MAF组(3.56±0.85)、实验组1(2.26±0.12)、实验组2(2.15±0.13),MAF组、实验组1、实验组2与对照组比较均有差异(P0.05),MAF组与实验组1、实验组2比较均有差异(P0.05)。结论:1.羊水栓塞发生时激活补体途径,补体C3a在AFE发生过程中起重要作用,中性粒细胞、NF-κB在羊水栓塞急性肺损伤中发挥重要的促炎作用。2.hAMSCs对羊水栓塞发生时C3a、MPO、NF-κB有一定的调节作用,能减轻羊水栓塞引起的肺损伤。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.468
【图文】：

间充质干细胞,生长形态

图 1-1 人羊膜间充质干细胞生长形态图（×100）注：图 A 示原代人羊膜间充质干细胞形态，呈星形、多角形、梭型；图 B 示第四代人羊膜间充干细胞形态，呈长梭型旋涡状或单层放射状生长。1.5.2 IHC 检测 hAMSCs 波形蛋白表达情况镜下观到第 4 代 hAMSCs 经过 DAB 染色后呈阳性，被染成浅红色，而对照组未被染色。见图 1-2。

间充质干细胞,波形蛋白,羊膜,免疫组化检测

间充质干细胞,流式细胞仪检测,表型,羊膜腔

图 1-3 流式细胞仪检测人羊膜间充质干细胞表型结果1.6 羊水栓塞模型的建立1.6.1 模拟人体建立孕鼠 AFE 模型1.6.1.1 实验分组40 只健康 SD 雌性大鼠随机分为 4 组：对照组（NS 组）10 只，羊水胎粪组（MAF组）10 只，实验组 1（hAMSCs+MAF 组；Experimental group 1，EG1）10 只，实验组 2（MAF+hAMSCs 组；Experimental group 2，EG2）10 只。1.6.1.2 制备羊水胎粪液术前 12 小时禁食，通过腹腔按 0.35mL/100g 注入 10%水合氯醛进行麻醉。麻醉生效后固定孕鼠，备皮，中下腹部正中切口约 3~4cm，逐层打开腹腔，轻拉子宫行子宫次全切术，切下的子宫温盐水纱布覆盖。分离腹主动脉及腹主静脉，手术钳夹闭手术切口，温盐水纱布覆盖。切下的子宫用一手托住且轻挤羊膜腔使大量羊水集中于下端，持 20mL 注射器于羊膜腔下端抽取羊水，恒温水浴箱暂存备用。剪开羊膜腔，取

【参考文献】