LAH4-L1-siMDR1纳米复合物逆转卵巢癌多药耐药性

发布时间：2020-07-17 09:34

【摘要】：研究背景及目的:卵巢癌是死亡率最高且预后最差的最常见三大妇科肿瘤之一。由于早期缺乏特异的临床症状及有效的检测手段,大部分患者确诊时已发生转移,而这其中有超过75%的进展期患者会复发并且出现对化疗药物的耐药性。大约有90%的进展期患者死于多药耐药的发生。为了克服卵巢癌耐药细胞株SKOV-3的多药耐药性,我们利用RNAi技术,LAH4-L1作为递送载体将针对主要编码P糖蛋白的siMDR1基因递送至SKOV-3细胞内,使其耐药基因MDR1沉默掉,逆转卵巢癌细胞的多药耐药性。通过自组装方式形成LAH4-L1-siMDR1纳米复合物(LSMCs)后我们对其物化表征、pH响应性、细胞毒性等进行了检测;然后分别在基因及蛋白水平上检测了转染以后目的基因MDR1的沉默效率及相关蛋白P-gp的表达情况;采用基因联用化疗药物的方式检测SKOV-3细胞的耐药性逆转情况;最后我们检测了转染以后对细胞周期以及迁移能力的影响。研究方法:1.LSCMs物化表征的检测(电位、粒径、形貌、siRNA包载能力、pH响应性);2.LSCMs对SKOV-3细胞内MDR1基因沉默效率的检测(基因水平、蛋白水平);3.CCK8实验(LSCMs毒性实验、耐药性逆转程度检测实验);4.细胞内吞实验及其机制实验;5.溶酶体逃逸及其机制实验;6.细胞迁移实验;7.细胞凋亡实验;8.细胞周期实验。研究结果:1.LSCMs(L/siMDR1=3/1)是一个带有弱正电荷的、粒径小于200nm的类圆形纳米颗粒,能够很好地将siMDR1包载起来并且具有pH响应性;2.通过RT-PCR对MDR1基因水平的检测可以看出LSCMs转染SKOV-3细胞的最佳质量比3/1,能够实现87.3%的MDR1的基因沉默,85%的P糖蛋白的表达下调;3.LSCMs(L/siMDR1=3/1)具有较低的细胞毒性,且通过基因转染与化疗药物联用的方式能够使细胞凋亡率从裸露siMDR1组的20.7%(PTX=3μg/ml)、27.9%(PTX=7.5μg/ml)、39.7%(PTX=15μg/ml)升至LSMCs转染组的52.5%(PTX=3μg/ml)、60.8%(PTX=7.5μg/ml)、73.7%(PTX=15μg/ml)。与阿霉素DOX联用时,细胞凋亡率从裸露组的38.4%(5μg/ml)和41%(10μg/ml)增至LSMCs组的50.6%(5μg/ml)和82.9%(10μg/ml);4.LSCs(L/Cy5-si=3/1)组的内吞过程基本上在1h之内完成,且是经脂质体介导的膜穴样凹陷及其他一些未知的途径进入SKOV-3细胞内的,并且该过程是能量依赖型的;5.LSCs(L/Cy5-si=3/1)能够在6h时完成SKOV-3细胞内的溶酶体逃逸过程,且质子化作用是LSCs成功逃离溶酶体的重要机制之一;6.经LSMCs(L/siMDR1=3/1)沉默MDR1基因以后的细胞迁移能力较未转染组降低了约50%,较裸露siMDR1转染组降低了约25%。Transwell实验的迁移细胞数从未转染组的722个减少至LSCs转染组的312个;7.通过基因转染联用化疗药物紫杉醇的方式检测了耐药性的逆转情况。细胞凋亡数从裸露siMDR1组的9.07%增至LSMCs(L/siMDR1=3/1)转染组的53.2%,未转染组的细胞凋亡数仅为7.81%;8.LSMCs(L/siMDR1=3/1)转染的细胞可以引起S期的增加,MDR1基因沉默以后联用紫杉醇可以引起细胞S期和G2期的同时增加。结论:用LAH4-L1-siMDR1纳米复合物转染卵巢癌耐药细胞株SKOV-3能够实现较高的沉默效率,逆转肿瘤的多药耐药性的同时还能够降低细胞的迁移能力。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31
【图文】：

安徽医科大学硕士学位论文我们利用正负电荷相互作用的自组装方式制备了 LAH4-L1-siMDR通过复合物转染卵巢癌耐药细胞株 SKOV-3，转染以后细胞内 MD沉默效率、P 糖蛋白的表达量降低程度以及通过基因转染联用化疗测 MDR1 基因沉默以后卵巢癌耐药细胞株 SKOV-3 的耐药性逆转程所关注的重点。除此以外，我们还检测了复合物的物化表征（电位NA 包载能力、pH 响应性）、摄取及其机制、溶酶体逃逸及其机制、周期及迁移能力的变化。剧 ATCC 官网上记载，SKOV-3 细胞是从腹水中提取出来的，对肿瘤坏死因子等多种细胞毒性药物耐药。图的概括总览图。

图 2：不同实验条件是转染效率的影响Figure 2：Effect of different conditions on transfection efficiency3.1.2 LSCs 与商业试剂、PAMAM 以及 PEI 递送效率的比较（Hela-GFP cell）如图我们可以看出 LSC（sL/siGFP=5/1）的沉默效率均大于商业试剂、PAMAM以及 PEI 的。所有对比试剂的沉默效率均是按照说明书，选择其最优实验条件下检测所得。

图 2：不同实验条件是转染效率的影响Figure 2：Effect of different conditions on transfection efficiency3.1.2 LSCs 与商业试剂、PAMAM 以及 PEI 递送效率的比较（Hela-GFP cell）如图我们可以看出 LSC（sL/siGFP=5/1）的沉默效率均大于商业试剂、PAMAM以及 PEI 的。所有对比试剂的沉默效率均是按照说明书，选择其最优实验条件下检测所得。

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