CDK9在卵巢癌进展中的作用及对细胞生物学影响的初步研究

发布时间：2020-07-17 11:09

【摘要】：研究背景和目的:卵巢癌是目前死亡率最高的女性生殖道恶性肿瘤,其发病率呈逐年上升趋势,严重威胁妇女生命和健康。美国癌症协会预计仅在2019年,美国约有22,530例新的卵巢癌病例和13,980例死亡病例。起病隐匿、发病晚、恶性程度高、易转移、预后差是卵巢癌的主要临床特点。肿瘤细胞减灭术和以铂类及紫杉醇为基础的联合化疗是晚期卵巢癌患者的主要治疗手段。超过50%的晚期卵巢癌患者在治疗后的最初5年内复发,获得了对标准化疗的耐药性,并对其他功能和结构上不相关的化疗药物产生了交叉耐药性。在过去的30年里,即使诊断和治疗水平的不断提高,卵巢癌患者的5年生存率并没有显著改善,仍徘徊于30~40%。因此迫切需要制定新的治疗策略,以改善卵巢癌患者的治疗。周期依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinases,CDKs)是丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,参与细胞周期和转录活性的调节。CDK1、CDK2、CDK4和CDK6主要参与细胞周期的调节,CDK8、CDK9、CDK12、CDK13和CDK19主要参与基因转录的调节。CDK7和CDK20与细胞周期和转录过程都有关。最近的研究表明,CDKs在许多癌症类型中过度表达,并最终导致了不受控制的细胞增殖和耐药性的产生。因此,CDKs逐渐成为人类癌症治疗的的潜在药物靶点。CDK4/6抑制剂帕博西尼(palbociclib)已经被食品和药物管理局批准为雌激素受体阳性和人表皮生长因子受体2阴性的晚期乳腺癌患者的临床一线治疗药物。目前有100多项I/II临床试验研究CDKs抑制剂对各种癌症类型的影响(http://clinicaltrials.gov/)。最近,CDK9逐渐成为癌症治疗的重要靶点,因为它在RNA转录、延伸和其他细胞生物学过程中发挥重要作用。CDK9和细胞周期蛋白T构成正相转录延伸因子b复合物,该复合物通过激活RNA聚合酶II(RNA polymerase II,RNAPII)的磷酸化促进转录延伸。CDK9已经被证实在多种肿瘤的发展过程中起着至关重要的作用,包括白血病、宫颈癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤和肺癌。然而,CDK9表达与卵巢癌临床预后之间的关系,CDK9与卵巢癌耐药形成的关系,以及靶向CDK9在卵巢癌中的治疗潜力仍不清楚。本研究分为以下三个部分:第一部分:CDK9在卵巢癌中的表达及其临床意义;第二部分:CDK9在卵巢癌细胞株中的生物学作用及其作用机制的初步探讨;第三部分:CDK9在卵巢癌耐药中的作用及其机制的探讨。第一部分:CDK9在卵巢癌中的表达及其临床意义目的:通过检测CDK9在原发的卵巢癌组织和其对应的转移和复发的肿瘤组织中的表达水平,结合患者临床病例资料,分析其表达与卵巢癌患者临床病理及预后的关系。方法:1.免疫组化染色法检测人类卵巢癌组织芯片中CDK9的表达水平。纳入本课题的研究对象是在美国哈佛大学麻省总医院接受治疗的26例卵巢癌患者,其中每例患者均有原发、转移和复发的肿瘤组织标本。2.应用配对t检验分析CDK9在原发、转移和复发的卵巢癌组织中的表达。3.应用Kaplan-Meier生存曲线分析CDK9的表达与卵巢癌患者无病生存率及总生存率之间的相关性。应用Cox比例风险回归模型确定无病生存期及总生存期的预后因子。4.采集26例患者的临床数据,Pearson卡方检验用来分析CDK9表达与卵巢癌患者临床病理参数间的相关性。5.采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测不同卵巢癌细胞系内CDK9蛋白的表达。6.采用Graph Pad Prism 7软件对数据进行统计学分析,所有数据用均数±标准差表示。应用配对t检验比较CDK9在原发、转移和复发的卵巢癌组织中的表达。应用Kaplan-Meier生存曲线分析CDK9的表达与卵巢癌患者无病生存率及总生存率之间的相关性。应用Cox比例风险回归模型确定无病生存期及总生存期的预后因子。Pearson卡方检验用来分析CDK9表达与卵巢癌患者临床病理参数间的相关性。以α=0.05作为检验水准。结果:1.CDK9蛋白主要表达在细胞核上,根据免疫组化CDK9的细胞核着色将其进行评分:1+,10%细胞核着色;2+,10-25%细胞核着色;3+,26-50%细胞核着色;4+,51-75%细胞核着色;5+,75%细胞核着色。CDK9低表达组为评分1+-2+,CDK9高表达组为评分3+-5+。2.免疫组化染色人类卵巢癌组织芯片的结果表明,原发、转移和复发的卵巢癌组织CDK9表达相对评分分别为2.58,3.23和3.19。其中转移组与原发组比较P=0.003,复发组与原发组比较P=0.001。3.生存分析结果显示,与CDK9低表达组卵巢癌患者相比,CDK9高表达组患者的无病生存率和总生存率明显缩短,且差异有统计学意义(P0.001)。Cox回归模型显示,高表达的CDK9对缩短的无病生存期和总生存期是一个显著的风险因子,风险比分别为4.1和5.39。4.CDK9低表达与CDK9高表达组患者在临床分期、组织分化、有无腹水和组织病理类型方面均没有统计学差异(P0.05)。5.CDK9在卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR8、A2780、IGROV-1、OVCAR5和CAOV-3中均表达。小结:1.原发病灶的卵巢癌组织CDK9的表达水平明显低于其对应的转移和复发的肿瘤组织。2.CDK9高表达与卵巢癌患者预后不良相关。3.CDK9表达于多个卵巢癌细胞系中。第二部分:CDK9在卵巢癌细胞株中的生物学作用及其作用机制的初步探讨目的:通过抑制CDK9表达对卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移、克隆形成及3D细胞成球的影响,初步探讨CDK9参与卵巢癌细胞生物学行为的分子机制。方法:1.应用MTT增殖试验法检测通过CDK9 si RNA或CDK9抑制剂LDC000067抑制CDK9的表达后对卵巢癌细胞增殖能力的影响。2.应用Western blot法检测通过CDK9 si RNA或CDK9抑制剂LDC000067作用后对CDK9、基因转录及凋亡相关蛋白的影响。3.采用Three-dimensional(3D)细胞培养法检测CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌细胞球体形成能力的影响。4.应用克隆形成实验检测CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌细胞克隆形成能力的影响。5.采用划痕修复实验检测CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌细胞迁移能力的影响。6.采用Graph Pad Prism 7软件对数据进行统计学分析,所有数据用均数±标准差表示。多组间的数值比较采用one-way ANOVA,组间两两比较采用LSD-t法,以α=0.05作为检验水准。结果:1.应用CDK9 si RNA或CDK9抑制剂LDC000067后卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力明显受到抑制,并呈现浓度依赖性。2.CDK9 si RNA可抑制CDK9蛋白的表达,而CDK9抑制剂LDC000067仅抑制CDK9的活性,其蛋白表达量并无显著性差异。CDK9 si RNA和LDC000067均可抑制转录蛋白RNAPII的磷酸化,并可增加促凋亡蛋白cleaved PARP及Bax的表达,同时抑制抗凋亡蛋白Mcl-1的表达,呈浓度依赖性。3.3D细胞培养结果显示,与对照组相比,应用CDK9抑制剂LDC000067后细胞球体直径明显缩小,并呈时间依赖性,差异有统计学意义(P0.05)。4.与对照组相比,应用CDK9抑制剂LDC000067后卵巢癌细胞克隆形成能力明显受到抑制,并呈浓度依赖性,差异有统计学意义(P0.05)。5.划痕实验结果显示,与未加药组相比,应用CDK9抑制剂LDC000067后细胞迁移距离明显受到抑制,并呈时间依赖性,差异有统计学意义(P0.05)。小结:1.抑制CDK9可降低卵巢癌细胞的增殖、3D细胞成球、克隆形成及迁移的能力。2.抑制CDK9可降低卵巢癌细胞转录蛋白RNAPII的磷酸化水平,同时促进细胞的凋亡。第三部分:CDK9在卵巢癌耐药中的作用及其机制的探讨目的:构建卵巢癌耐药细胞系,探讨CDK9在卵巢癌耐药中的作用。抑制CDK9的表达对卵巢癌耐药细胞化疗敏感性的影响并探讨其潜在的分子机制。方法:1.采用紫杉醇浓度递增的诱导方法处理药物敏感性的卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞,经过6个月左右的加药,建立紫杉醇耐药的卵巢癌细胞SKOV3TR和OVCAR8TR。2.应用Western blot法比较卵巢癌药物敏感细胞株和其构建的紫杉醇耐药细胞株中CDK9、Pgp、s2 RNAPII、RNAPII、p-Stat3及Stat3的蛋白水平。3.应用MTT增殖试验法检测CDK9 si RNA或CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌耐药细胞株化疗敏感性的影响。4.采用Compusyn软件计算combination index(CI)值,分析紫杉醇联合CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌耐药细胞增殖的相互作用。5.应用Western blot法检测通过CDK9 si RNA作用后对耐药细胞株CDK9、Stas3信号通路、RNA转录及凋亡相关蛋白的影响。6.应用Western blot法检测单独应用紫杉醇或CDK9抑制剂LDC000067以及联合应用紫杉醇和LDC000067后对耐药细胞株CDK9、Stas3信号通路、转录及凋亡相关蛋白的影响。7.采用3D细胞培养法检测CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌耐药细胞球体形成能力的影响。8.应用克隆形成实验检测CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌耐药细胞克隆形成能力的影响。9.采用划痕修复实验检测CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌耐药细胞迁移能力的影响。10.采用Graph Pad Prism 7软件对数据进行统计学分析,所有数据用均数±标准差表示。多组间的数值比较采用one-way ANOVA,组间两两比较采用LSD-t法,以α=0.05作为检验水准。结果:1.紫杉醇耐药的卵巢癌细胞SKOV3TR和OVCAR8TR对紫杉醇的敏感性显著降低,而亲代细胞则保持对紫杉醇的敏感性。2.SKOV3/SKOV3TR和OVCAR8/OVCAR8TR均表达一定蛋白水平的CDK9,但是,SKOV3TR和OVCAR8TR均比其对应的敏感细胞SKOV3和OVCAR8表达较高蛋白水平的CDK9。Pgp、s2 RNAPII及p-Stat3的蛋白水平在耐药细胞中表达均高于敏感细胞株,且差异有统计学意义(P0.05)。3.应用CDK9 si RNA或CDK9抑制剂LDC000067后可提高卵巢癌耐药株SKOV3TR和OVCAR8TR对紫杉醇的敏感性。4.Compusyn软件计算显示,联合应用紫杉醇和CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌耐药细胞的增殖有协同的抑制效应,可增加耐药细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性(CI0.7)。CI1.1,拮抗作用;0.9 1.1,叠加效应;0.7 0.9,微弱协同效应;0.3 0.7,协同效应;0.3,强协同效应。5.CDK9 si RNA可抑制卵巢癌耐药细胞转录蛋白RNAPII和信号通路蛋白Stas3的磷酸化,并可增加促凋亡蛋白Bax的表达,同时降低抗凋亡蛋白Mcl-1的表达,并呈浓度依赖性。6.Western blot法结果显示,联合应用紫杉醇和CDK9抑制剂LDC000067可增强其单一用药的作用,可抑制卵巢癌耐药细胞转录蛋白RNAPII和信号通路蛋白Stas3的磷酸化,并可增加促凋亡蛋白cleaved PARP及Bax的表达,同时降低抗凋亡蛋白Mcl-1的表达。7.3D细胞培养结果显示,与对照组相比,应用CDK9抑制剂LDC000067后耐药细胞球体直径明显缩小,并呈时间依赖性,差异有统计学意义(P0.05)。8.与对照组相比,应用CDK9抑制剂LDC000067后卵巢癌耐药细胞克隆形成能力明显受到抑制,并呈浓度依赖性,差异有统计学意义(P0.05)。9.与未加药组相比,应用CDK9抑制剂LDC000067后卵巢癌耐药细胞迁移距离明显受到抑制,并呈时间依赖性,差异有统计学意义(P0.05)。小结:1.CDK9在卵巢癌耐药细胞株中表达高于其敏感细胞株。2.抑制CDK9可提高卵巢癌耐药细胞对紫杉醇的敏感性。3.抑制CDK9可降低卵巢癌耐药细胞转录蛋白RNAPII和Stat3信号通路的磷酸化水平,同时促进细胞的凋亡。4.联合应用紫杉醇和CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌耐药细胞的增殖有协同的抑制效应。5.抑制CDK9可降低卵巢癌耐药细胞克隆形成、3D细胞成球及迁移的能力。结论:1.CDK9高表达与卵巢癌的复发及转移关系密切,并与患者的预后呈现负相关。2.CDK9可能通过激活基因转录,抑制凋亡,进而促进卵巢癌细胞的增殖。3.CDK9可能参与了卵巢癌耐药的形成,抑制CDK9表达可有效逆转耐药细胞对紫杉醇的敏感性。4.CDK9有作为卵巢癌预后指标和靶向治疗的潜在价值。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.31
【图文】：

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第一部分 CDK9 在卵巢癌中的表达及其临床意义3.2 原发卵巢癌组织与其对应的转移及复发的卵巢癌组织中 CDK9的表达通过免疫组化法比较 CDK9 在原发、转移和复发的卵巢癌组织中的表达情况。CDK9 蛋白主要表达在细胞核上，根据免疫组化 CDK9 的细胞核着色将其进行评分：1+，<10%细胞核着色；2+，10-25%细胞核着色；3+，26-50%细胞核着色；4+，51-75%细胞核着色；5+，>75%细胞核着色。HE 和 CDK9 免疫组化代表性结果见图 1.1。随后，我们对卵巢癌组织芯片进行评分，结果显示，原发、转移和复发的卵巢癌组织 CDK9 表达分别为 2.58，3.23 和 3.19。尽管转移和复发的卵巢癌组织 CDK9 的表达差异无统计学意义（P=0.98），原发病灶的卵巢癌组织 CDK9 的表达水平却明显低于其对应的转移和复发的肿瘤组织，其中转移组与原发组比较 P=0.003，复发组与原发组比较 P=0.001，见图 1.2。

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图 1.2 CDK9在原发，转移和复发卵巢癌组织中的表达3.3 CDK9 的表达与患者预后的关系根据原发病灶卵巢癌组织中 CDK9 的免疫组化评分将患者进行分组低表达组为评分 1+-2+，CDK9 高表达组为评分 3+-5+，各组分别 13 例患用 Kaplan-Meier 生存曲线分析 CDK9 的表达与卵巢癌患者无病生存率及率之间的相关性。结果显示，与 CDK9 低表达组卵巢癌患者相比，CDK9组患者的无病生存率和总生存率明显缩短，且差异有统计学意义（P<0.0图 1.3-1.4。具体地说，CDK9 低表达组的中位无病生存期和总生存期分个月和 60.1 个月，而 CDK9 高表达组的中位无病生存期和总生存期分别月和 16.35 个月。应用 Cox 比例风险回归模型确定无病生存期及总生存期的预后因子显示，高表达的 CDK9 对缩短的无病生存期和总生存期是一个显著的风Primary MetastaticRecurrent

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图 1.3 CDK9表达水平与卵巢癌患者无病生存率的相关性分析注：DFS：disease-free survival，无病生存期。无病生存期是从疾病诊断到复发时间。图 1.4 CDK9表达水平与卵巢癌患者总生存率的相关性分析

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